Caracterización molecular de la resistencia de Mycobacterium tuberculosis en un área rural de Angola

Abstract

La República d’Angola és un país situat en la costa occidental del sud d’Àfrica que es troba dins dels 30 països amb major càrrega de tuberculosis i major càrrega de tuberculosis multirresistent. No obstant, no existeixen dades reals sobre la prevalença de tuberculosis multirresistent a causa de l’absència de laboratoris de microbiològica capaços de realitzar cultius de micobacteris, així com, l’absència de mètodes ràpids per a la detecció de resistència a Mycobacterium tuberculosis complex. L’hospital Nosha Senhora da Paz, ubicat a Cubal, municipi de 250.000 habitants de la província de Benguela en el sud del país, es un centre de referencia de tuberculosis a nivell nacional. Des de 2008 treballa amb col·laboració amb l’hospital Universitari Vall d’Hebron de Barcelona en diferents projectes dins l’àmbit sanitari. Un d’ells va permetre que entre abril de 2014 i juliol de 2015, amb el suport financer de PROBITAS, es dugués a terme un estudi epidemiològic que va consistir en realitzar cultiu i antibiograma de micobacteris mitjançant mètodes fenotípics i genotípics a tots els pacients diagnosticats de tuberculosis, també es van realitzar proves ràpides de detecció de resistència a rifampicina (GeneXpert MTB/RIF) a tots els pacients prèviament tractats i a tots els casos nous que persistien amb bacil·loscòpia positiva després de dos mesos de tractament. En el període de estudi es van incloure un total de 422 pacients, 311 (74%) van ser casos nous i els restants 111 (26%) eren pacients prèviament tractats. Basant-nos en el antibiograma fenotípic vam registrar un 8,0% de multi-resistència entre els casos nous i un 71,1% entre els pacients prèviament tractats. Aquestes dades revelen xifres de multi-resistència alarmants, més de quatre vegades la prevalença de tuberculosis multi-resistent estimada per l’Organització Mundial de la Salud. En paral·lel també es va avaluar el perfil de les mutacions associades a resistència a rifampicina (gen rpoB) dels aïllats circulants, ja que el rendiment de les proves diagnostiques ràpides de detecció de resistència a rifampicina es podien veure afectades per variacions dels aïllats circulants entre regions geogràfiques. En totals es van detectar 87 aïllats resistents a rifampicina, 74 casos (85,1%) tenien mutacions en la regió determinant de resistència a rifampicina associades a un alt nivell de resistència, 9 casos (10,3%) tenien mutacions de resistència en la regió determinat de resistència a rifampicina associades a un baix nivell de resistència, 2 casos (2,3%) eren aïllats heteroresistents i 2 casos (2,3%) no tenien mutacions en el gen rpoB. Es a dir, en aquests dos últims casos els mètodes moleculars de detecció de resistència, per si sols, no haguessin sigut capaços de detectar aquests dos aïllats com a resistents. També cal destacar que entre els aïllats sensibles a la rifampicina es van detectar dos aïllats portadors de mutacions en la regió determinant de resistència a rifampicina no associades a resistència que es podrien haver identificat erròniament com aïllats resistents pel mètodes moleculars de detecció de resistència. Malgrat això, aquestes dades recolzen l’ús generalitzat de probes moleculars ràpides per a la detecció de resistència a rifampicina. En resum, les dades que aquí s’exposen confirmen que la tuberculosis es un problema de gran magnitud a Angola. No només per la seva elevada incidència sinó per l’alta prevalença de tuberculosis multi-resistent en la regió, especialment entre els casos prèviament tractats. Tot això reforça la necessitat de incorporar proves ràpides de detecció de resistències en la pràctica assistencial, la construcció de laboratoris amb capacitat per a realitzar cultius i antibiogrames de micobacteris, la incorporació d’infraestructures per a l’aïllament i correcte maneig/tractament dels pacients, així com, la formació del personal sanitari.

La República de Angola es un país ubicado en la costa occidental del sur de África que se encuentra dentro de los 30 países con mayor carga de tuberculosis y mayor carga de tuberculosis multirresistente. Aunque no existen datos reales de prevalencia de tuberculosis multirresistente debido a la falta de laboratorios de microbiología capaces de realizar cultivos de micobacterias y la ausencia de métodos rápidos de detección de resistencia a Mycobacterium tuberculosis complex. El Hospital Nossa Senhora da Paz, situado en Cubal, un municipio de unos 250.000 habitantes de la provincia de Benguela, en el sur del país, es un centro de referencia de tuberculosis a nivel nacional. Desde 2008 trabaja en colaboración con el Hospital Universitario Vall d’Hebron de Barcelona en diferentes proyectos dentro del ámbito sanitario. Uno de ellos permitió que entre abril de 2014 y julio de 2015, con el soporte financiero de PROBITAS, se llevará a cabo un estudio epidemiológico en el que se realizaron cultivos de esputo y pruebas de sensibilidad por métodos fenotípicos y genotípicos a todas las muestras basales de los pacientes con tuberculosis, así como una prueba rápida de reacción en cadena de la polimerasa y de resistencia a rifampicina (GeneXpert MTB/RIF) a todos los pacientes previamente tratados y a aquellos casos nuevos en los que la baciloscopia fue positiva tras dos meses de tratamiento. En el periodo de estudio se incluyeron un total de 422 pacientes, 311 (74%) fueron casos nuevos y los restantes 111 (26%) eran pacientes previamente tratados. Basándonos en el antibiograma fenotípico registramos un 8,0% de multirresistentes en casos nuevos y un 71,1% en pacientes previamente tratados. Estos datos revelan cifras de multirresistencia alarmantes, más de cuatro veces la prevalencia de tuberculosis multirresistente estimada por la Organización Mundial de la Salud. Paralelamente, también se evaluó el perfil de mutaciones asociadas a resistencia a rifampicina (gen rpoB) de las cepas circulantes, ya que la utilidad de las técnicas moleculares de detección de resistencia podía verse afectada por variaciones de estas entre diferentes regiones geográficas. Encontramos un total de 87 aislados resistentes a rifampicina. De los cuales, 74 casos (85,1%) tenían mutaciones de resistencia asociadas a alto nivel de resistencia en la región determinante de resistencia a rifampicina (RRDR), 9 casos (10,3%) tenían mutaciones de resistencia asociadas a bajo nivel de resistencia en la región de resistencia a rifampicina, 2 casos (2,3%) eran aislados heterorresistentes y 2 casos (2,3%) no tenían mutaciones en el gen rpoB. Por lo que los métodos moleculares de detección de resistencia, por sí solos no hubieran sido capaces de detectar como resistentes estas dos últimas cepas. También hay que desatacar que entre los aislados sensibles a rifampicina se detectaron dos aislados (0,9%) portadores de mutaciones con cambio de sentido en la región determinante de resistencia a rifampicina no asociadas a resistencia que podrían haber sido identificados erróneamente como aislados resistentes por los métodos moleculares de detección de resistencia. A pesar de todo ello, estos datos respaldan el uso generalizado de los ensayos moleculares para la detección rápida de resistencia a rifampicina. En resumen, los datos aquí expuestos confirman que la tuberculosis es un problema de gran magnitud en Angola. No sólo por la elevada incidencia sino por la alta prevalencia de tuberculosis multirresistente, sobre todo en casos previamente tratados. Esto refuerza la necesidad de la incorporación en la práctica asistencial diaria de métodos de diagnóstico rápido de resistencias, la construcción de laboratorios con capacidad de realizar cultivos y antibiogramas de micobacterias, la incorporación de infraestructuras para el aislamiento y correcto manejo/tratamiento de los pacientes, así como la formación de personal sanitario.

The Republic of Angola is a country located on the western coast of southern Africa that is among the 30 countries with the highest burden of tuberculosis and the highest burden of multidrug-resistant tuberculosis. Although there are no real data on the prevalence of multidrug-resistant tuberculosis due to the lack of microbiology laboratories capable of performing mycobacterial cultures and the absence of molecular assays for the rapid detection of resistance to Mycobacterium tuberculosis complex. The Nossa Senhora da Paz Hospital, located in Cubal, a municipality of about 250,000 inhabitants in the province of Benguela, in the south of the country, is a reference center for tuberculosis nationwide. Since 2008 he has been working in collaboration with the Vall d’Hebron University Hospital in Barcelona on different projects within the healthcare field. One of them allowed that between April 2014 and July 2015, with the financial support of PROBITAS, an epidemiological study will be carried out in which sputum cultures and susceptibility testing were performed by phenotypic and genotypic methods on all baseline samples of tuberculosis patients, as well as, a rapid polymerase chain reaction test to detect rifampicin resistance-associated mutations (GeneXpert MTB / RIF) in all previously treated patients and in new cases in which the smear test was positive after two months of treatment. In the study period, a total of 422 patients were included, 311 (74%) were new cases and the remaining 111 (26%) were previously treated patients. Based on the phenotypic antibiogram, we registered 8,0% of multidrug resistance in new cases and 71,1% in previously treated patients. These data reveal alarming multidrug-resistance figures, more than four times the prevalence of multidrug-resistant tuberculosis estimated by the World Health Organization. At the same time, the profile of mutations associated with rifampicin resistance (rpoB gene) of the circulating strains was also evaluated, since the usefulness of molecular resistance detection techniques could be affected by variations in the distribution of mutations between different geographic regions. We found a total of 87 rifampicin-resistant isolates. Of which, 74 cases (85.1%) had mutations in the rifampicin resistance determining region associated with high level resistance, 9 cases (10.3%) had mutations in the rifampicin resistance determining region associated with low level resistance, 2 cases (2.3%) were heteroresistant isolates and 2 cases (2.3%) did not have mutations in the rpoB gene. Therefore, molecular assays for detection resistance, by themselves, would not have been able to detect these last two strains as resistant. It should also be noted that among the rifampicin-sensitive isolates, two isolates (0,9%) had missense mutations in the rifampicin resistance determining region not associated with resistance that could have been erroneously identified as resistant isolates by molecular assays for detection resistance. Despite this, these data support the widespread use of molecular assays for the rapid detection of rifampicin resistance. In summary, the data presented here confirm that tuberculosis is a major problem in Angola. Not only because of the high incidence but also because of the high prevalence of multidrug-resistant tuberculosis, especially in previously treated cases. This reinforces the need for the incorporation into daily healthcare practice of methods for rapid diagnosis of resistance, the construction of laboratories with the capacity to carry out cultures and antibiograms of mycobacteria, the incorporation of infrastructures for the isolation and correct management/treatment of patients, as well as the training of health personnel.