Estudio estructural y funcional de la proteína Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) en mode/os ce/u/ares y murinos. lmplicaciones en enfermedades del neurodesarrollo

Abstract

[spa] Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) es uno de los genes más comúnmente asociados a la susceptibilidad de padecer un trastorno mental grave, como esquizofrenia, trastorno bipolar o depresión mayor. La proteína codificada por este gen, DISC1, se expresa mayoritariamente en el cerebro y presenta una distribución celular ubicua, aunque está enriquecida en las mitocondrias. DISC1 actúa como proteína de andamiaje, interactuando con múltiples proteínas para ejercer sus funciones. Dicha característica le confiere la capacidad de regular diversas vías importantes para el correcto mantenimiento de la función neuronal, como la proliferación y diferenciación neuronal, migración celular, crecimiento neurítico, tráfico intracelular y plasticidad sináptica. La complejidad estructural que caracteriza DISC1, junto a la identificación de alrededor de 40 tránscritos resultantes del procesamiento alternativo, dificultan el estudio de esta proteína y sugieren que alguna de las múltiples funciones atribuidas pueda ser isoforma-específica. Teniendo en cuenta la existencia de múltiples isoformas de DISC1, las cuales están poco estudiadas, uno de los objetivos de esta tesis ha sido estudiar la expresión de diversas isoformas de DISC1 en diferentes líneas celulares humanas y en el proceso de diferenciación neuronal. Se han identificado niveles elevados de algunos tránscritos de DISC1 no solo en células cerebrales, si no también en células de origen epitelial. Analizando la expresión de diversas isoformas de DISC1 durante el proceso de diferenciación neuronal en el modelo celular SH-SY5Y, se ha observado que DISC1 se sobreexpresa a medida que estas células van adquiriendo la morfología neuronal. A su vez, también se ha observado que el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) induce un bloqueo post-transcripcional de la expresión de DISC1 Lv. Análisis de perfiles de expresión en respuesta al BDNF realizados mediante microarrays de expresión, han permitido identificar la posible regulación de DISC1 por el micro-ARN-4485. Para profundizar en la función de DISC1, se han generado células con deleciones en su región N-terminal mediante el sistema CRISPR/Cas9. Las células editadas han mostrado deficiencias bioenergéticas, acompañadas de la alteración de las crestas mitocondriales y un enriquecimiento de DISC1 en el retículo endoplasmático. La afectación de la función cognitiva asociada a los trastornos mentales se ha analizado en un modelo murino de Disc1 que contiene una deleción de 25 pares de bases en el gen Disc1, la cual afecta a la expresión de una única isoforma, DISC1 Lv. Los resultados obtenidos de los análisis de comportamiento llevados a cabo no han sido concluyentes. Sin embargo, a nivel proteómico este modelo murino evidencia dos características distintivas: (i) presenta significativamente menos oligómeros de DISC1 en los puntos de contacto mitocondria – retículo endoplasmático; (ii) sus membranas mitocondriales presentan mayor sensibilidad por los detergentes anulares, lo que sugiere una composición lipídica distinta a la de los ratones salvajes, y una mayor susceptibilidad a padecer alteraciones estructurales de complejos proteicos de membrana grandes, como es el complejo I de la cadena respiratoria.

[cat] Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) és un dels gens més comunament associats a la susceptibilitat de patir un trastorn mental greu, com esquizofrènia, trastorn bipolar o depressió major. La proteïna codificada per aquest gen, DISC1, s’expressa majoritàriament en el cervell i presenta una distribució cel·lular ubiqua, encara que està enriquida en les mitocòndries. DISC1 actua com a proteïna de bastida, interactuant amb múltiples proteïnes per a exercir les seves funcions. Aquesta característica li confereix la capacitat de regular diverses vies importants per al correcte manteniment de la funció neuronal, com la proliferació i diferenciació neuronal, migració cel·lular, creixement neurític, tràfic intracel·lular i plasticitat sinàptica. La complexitat estructural que caracteritza DISC1, juntament amb la identificació d’uns 40 transcrits resultants del processament alternatiu, dificulten l’estudi d’aquesta proteïna i suggereixen que alguna de les múltiples funcions atribuïdes pot ser isoforma-específica. Tenint en compte l’existència de múltiples isoformes de DISC1, les quals estan poc estudiades, un dels objectius d’aquesta tesi ha estat estudiar l’expressió de diverses isoformes de DISC1 en diferents línies cel·lulars humanes i en el procés de diferenciació neuronal. S’han identificat nivells elevats d’alguns transcrits de DISC1 no només en cèl·lules cerebrals, sinó també en cèl·lules d’origen epitelial. Analitzant l’expressió de diverses isoformes de DISC1 durant el procés de diferenciació neuronal en el model cel·lular SH-SY5Y, s’ha observat que DISC1 es sobreexpressa a mesura que aquestes cèl·lules van adquirint la morfologia neuronal. A la vegada, també s’ha observat que el factor neurotròfic derivat de cervell (BDNF) indueix un bloqueig posttranscripcional de l’expressió de DISC1 Lv. Anàlisis de perfils d’expressió en resposta al BDNF realitzats mitjançant microarrays d’expressió, han permès identificar la possible regulació de DISC1 pel micro-ARN-4485. Per aprofundir en la funció de DISC1, s’han generat cèl·lules amb delecions en la seva regió N-terminal mitjançant el sistema CRISPR/Cas9. Les cèl·lules editades han mostrat deficiències bioenergètiques, acompanyades de l’alteració de les crestes mitocondrials i un enriquiment de DISC1 en el reticle endoplasmàtic. L’afectació de la funció cognitiva associada als trastorns mentals s’ha analitzat en un model murí de Disc1, que conté una deleció de 25 parells de bases en el gen Disc1, la qual afecta a l’expressió d’una única isoforma, DISC1 Lv. Els resultats obtinguts dels anàlisis de comportament portats a terme no han estat concloents. Tot i així, a nivell proteòmic aquest model murí evidencia dues característiques distintives: (i) presenta significativament menys oligòmers de DISC1 en els punts de contacte mitocòndria – reticle endoplasmàtic; (ii) les seves membranes mitocondrials presenten major sensibilitat pels detergents anulars, el que suggereix una composició lipídica diferent a la dels ratolins salvatges, i una major susceptibilitat a patir alteracions estructurals de complexes proteics de membrana grans, com és el complex I de la cadena respiratòria.

[eng] Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) is one of the main genes associated with the susceptibility of a major mental disorder, such as schizophrenia, bipolar disorder or major depression. The encoded protein of this gene, DISC1, is mainly expressed in the brain and has an ubiquitous cellular distribution, being enriched in the mitochondria. DISC1 acts as a scaffold protein, interacting with multiple proteins to achieve their functions and allowing the regulation of various signaling pathways responsible for maintaining proper neuronal function, such as the neuronal proliferation and differentiation, cellular migration, neuritic growth, intracellular trafficking and synaptic plasticity. The structural complexity of DISC1, in association with the identification of around 40 transcripts as a result of the alternative splicing, make it difficult the study of this protein and suggest that some of the multiple associated functions could be isoform specific. Taking into account the existence of multiple isoforms of DISC1, which have been poor studied, one objective of this thesis has been to study the expression profiles of various DISC1 isoforms in different human cellular lines and in the neuronal differentiation. High levels of some DISC1 transcripts have been identified not only in brain cells, but also in epithelial cells. Analyzing the DISC1 isoforms expression during the neuronal differentiation in the cellular model SH-SY5Y, it has been observed that DISC1 is upregulated when these cells are changing into a neuronal morphology. Also, at the same time, it has been observed that the brain derived neurotrophic factor (BDNF) induces post-transcriptional blocking of DISC1 Lv expression. An analysis to study the expression profiles in response to BDNF were carried out by microarrays, resulting in the identification of a possible DISC1 regulator, the micro-RNA-4485. To deepen in the DISC1 function, it has been generated cells with an N-terminal protein deletion by the CRISPR/Cas9 system. These cells showed bioenergetic deficiencies, mitochondrial crista alterations and a DISC1 enrichment in the endoplasmic reticulum. Impaired cognitive function associated to mental disorders has been analyzed by the Disc1 mouse model, which has a 25 base pairs deletion in the Disc1 gene that affects the expression of one unique isoform, DISC1 Lv. The behavior analysis carried out were inconclusive. Nevertheless, at a proteomic level this mouse model evidence two distinctive characteristics: (i) it shows significantly less levels of DISC1 oligomers in mitochondria – endoplasmic reticulum contacts sites; (ii) their mitochondrial membranes have more sensibility for the ring detergents, suggesting a different lipid composition from wild type mice, and more susceptibility to structural alterations for the high membrane protein complexes, such as the respiratory chain complex I.