Control of reproduction in the flathead grey mullet Mugil cephalus: Broodstock management, hormonal therapies and transcriptomic signature

Abstract

La llisa (Mugil cephalus) és una bona candidata per a la diversificació de les espècies europees cultivades per la seva adaptabilitat a diferents condicions de cultiu, alimentació omnívora i perfil ecològic. El desenvolupament futur depèn, en part, del control reproductiu en condicions intensives, necessari per proporcionar alevins criats en vivers per tal que les industries no depenguin de la captura d’alevins o de la inducció d'individus salvatges madurs, pràctiques insostenibles a llarg termini. Per tant, la present tesi s'ha centrat en aspectes de la gestió dels reproductors i en tractaments hormonals per superar la disfunció reproductiva d’aquesta espècie en captivitat. Durant els tractaments hormonals (agost – novembre), peixos salvatges i originaris d’una granja semi-extensiva mantinguts en condicions intensives —de tres mesos fins a 3,5 anys—, presentaven oòcits previtel·logènics o un percentatge baix (<10%) en vitel·logènesi primerenca, no tenien esperma o en produïen una gota viscosa. Contràriament, les femelles salvatges (n = 44) del Mediterrani occidental eren a vitel·logènesi, essent la posta al setembre i l’octubre, d’acord amb l'examen macroscòpic, histològic i biomètric realitzat. Per identificar els requisits nutricionals dels reproductors, es van examinar els canvis en la composició de lípids i d’àcids grassos del múscul, fetge i ovari de femelles salvatges en (i) previtel·logènesi (n = 7), (ii) vitel·logènesi primerenca (n = 6), (iii) vitel·logènesi tardana (n = 7) i (iv) després de la posta (n = 7). El contingut total de lípids va ser constant i baix al múscul (3,85 - 4,92 %), alt al fetge (18,46 - 22,62 %), i va augmentar durant el desenvolupament gonadal (4,90 - 34,59 %) disminuint després de la posta. Durant la vitel·logènesi, es va produir la mobilització d'àcids grassos poliinsaturats (AGPI) n-3 del fetge. El percentatge d'àcids grassos saturats, principalment 16:0, i d’AGPI, principalment dels àcids eicosapentaenoic, docosahexaenoic i araquidònic, va disminuir significativament als ovaris. En canvi, els àcids grassos monoinsaturats, principalment 16:1 i 17:1 d'origen bacterià, van augmentar significativament. L’estudi de les respostes dels peixos als pellets (2, 4, 6, 8 mm de diàmetre) i l’avaluació de l'àrea d'alimentació van indicar que els diàmetres òptims pels juvenils (~ 360 g) eren de 2 i 4 mm, mentre pels adults (~ 930 g) era de 4 mm, i que preferien alimentar-se a la columna d'aigua i al fons, enlloc de la superfície. El tractament a llarg termini amb injeccions setmanals d’hormona fol·liculostimulant recombinant (rFsh) (dosis de 4 a 15 µg kg-1) i/o d’hormona luteïnitzant (rLh) (dosis de 2,5 a 24 µg kg-1) produïdes a les cèl·lules CHO (Ovari de Hàmster Xinès) va induir i completar la vitel·logènesi al 100 % de femelles (n = 29) amb el tractament complet. El 100% dels mascles (n = 13) van produir esperma. La dosi inicial de 30 µg kg-1 rLh va induir la maduració dels oòcits 24 h rere l’administració. Les dosis resolutives de 40 mg kg-1 progesterona (n = 9 femelles) i 30 µg kg-1 rLh (n = 6) van donar lloc, respectivament, a un 89 % i 100 % d'èxit de posta amb un 63 ± 21 % de fertilització i un 58 ± 23 % d'eclosió. L'expressió diferencial de gens i vies moleculars entre les diferents etapes de la vitel·logènesi induïdes amb rFsh i rLh, avaluades després de realitzar la seqüenciació del transcriptoma (RNAseq) i l’assemblatge “de novo”, van mostrar ser típiques de l'oogènesi natural en peixos. Les troballes d'aquesta tesi han permès controlar la reproducció de la llisa en condicions de cultiu intensiu, i plantegen la possibilitat d'utilitzar el tractament amb rFsh i rLh per induir la posta fora de temporada i en altres espècies amb trastorns reproductius similars.

El múgil (Mugil cephalus) es un buen candidato para la diversificación de las especies europeas cultivadas por su adaptabilidad a diferentes condiciones de cultivo, alimentación omnívora y perfil ecológico. El desarrollo futuro depende, en parte, del control reproductivo en condiciones intensivas, necesario para proporcionar alevines criados en viveros para que las industrias no dependan de la captura de alevines o de la inducción de individuos salvajes maduros, prácticas insostenibles a largo plazo. Por lo tanto, la presente tesis se ha centrado en aspectos de la gestión de los reproductores y en tratamientos hormonales para superar la disfunción reproductiva de esta especie en cautividad. Durante los tratamientos hormonales (agosto – noviembre), peces salvajes y originarios de una granja semi-extensiva mantenidos en condiciones intensivas —de tres meses a 3,5 años—, presentaban ovocitos previtelogénicos o un porcentaje bajo (<10%) en vitelogénesis temprana, no tenían esperma o producían una gota viscosa. Contrariamente, las hembras salvajes (n = 44) del Mediterráneo occidental estaban en vitelogénesis, siendo el desove en septiembre y octubre, de acuerdo con el examen macroscópico, histológico y biométrico realizado. Para identificar los requisitos nutricionales de los reproductores, se examinaron los cambios en la composición de lípidos y ácidos grasos del músculo, hígado y ovario de hembras salvajes en (i) previtelogénesis (n = 7), (ii) vitelogénesis temprana (n = 6), (iii) vitelogénesis tardía (n = 7) y (iv) tras la puesta (n = 7). El contenido total de lípidos fue constante y bajo en el músculo (3,85 - 4,92%), alto en el hígado (18,46 - 22,62%), y aumentó durante el desarrollo gonadal (4,90 - 34,59%) disminuyendo tras la puesta. Durante la vitelogénesis, se produjo la movilización de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) n-3 del hígado. El porcentaje de ácidos grasos saturados, principalmente 16:0, y de AGPI, principalmente de los ácidos eicosapentaenoico, docosahexaenoico y araquidónico, disminuyó significativamente en los ovarios. En cambio, los ácidos grasos monoinsaturados, principalmente 16:1 y 17:1 de origen bacteriano, aumentaron significativamente. El estudio de las respuestas de los peces a los pellets (2, 4, 6, 8 mm de diámetro) y la evaluación del área de alimentación indicaron que los diámetros óptimos para juveniles (~ 360 g) eran de 2 y 4 mm, mientras para adultos (~ 930 g) era de 4 mm, y que preferían alimentarse en la columna de agua y en el fondo, en vez de en la superficie. El tratamiento a largo plazo con inyecciones semanales de hormona foliculoestimulante recombinante (rFsh) (dosis de 4 a 15 µg kg-1) y/o de hormona luteinizante (rLh) (de 2,5 a 24 µg kg-1) producidas en células CHO (Ovario de Hámster Chino) indujo y completó la vitelogénesis en el 100 % de hembras (n = 29) con el tratamiento completo. El 100% de machos (n = 13) produjeron esperma. La dosis inicial de 30 µg kg-1 rLh indujo la maduración de los ovocitos 24 h después. Las dosis resolutivas de 40 mg kg-1 progesterona (n = 9 hembras) y 30 µg kg-1 rLh (n = 6) dieron lugar, respectivamente, a un 89 % y 100 % de desoves con 63 ± 21% de fertilización y 58 ± 23% de eclosión. La expresión diferencial de genes y vías moleculares entre los diferentes estados vitelogénicos inducidos con rFsh y rLh, evaluada tras realizar la secuenciación del transcriptoma (RNAseq) y el ensamblaje “de novo”, mostraron ser típicas de la ovogénesis natural en peces. Los hallazgos de esta tesis han permitido controlar la reproducción del múgil en cultivo intensivo, y plantean la posibilidad de utilizar el tratamiento con rFsh y rLh para inducir el desove fuera de temporada y en otras especies con trastornos reproductivos similares.

The flathead grey mullet (Mugil cephalus) is a good candidate for the diversification of European species in aquaculture due to characteristics such as, adaptability to different culture conditions, omnivorous feeding and ecological profile. The future development partly relies on the control of reproduction in intensive conditions, which is needed to provide hatchery-reared fry to end the industries dependence on wild fry or the induction of wild mature individuals, which are unsustainable in the long term. Therefore, the present thesis has focused on several aspects related to broodstock management and on hormonal treatments to overcome the reproductive dysfunction this species presents in captivity. The present thesis found that, during hormonal treatments (August – November), wild fish and fish from a semi-extensive farm held in captive conditions — from three months to 3.5 years—, presented only previtellogenic oocytes or had a low percentage (<10 %) of early-vitellogenic oocytes, had no milt or produced a viscous drop. Contrarily, wild females (n = 44) in the Western Mediterranean had started vitellogenesis, and between September and October spawned, according to macroscopic, histological, and biometric examination. To identify the broodstock nutritional requirements, changes in lipid and fatty acid composition of muscle, liver and ovary of wild flathead grey mullet females at (i) previtellogenesis (n = 7), (ii) early-vitellogenesis (n = 6), (iii) late-vitellogenesis (n =7), and (iv) post-spawning period (n = 7) were characterized. Total lipid content was constant and low in the muscle (3.85 - 4.92 %), high in the liver (18.46 - 22.62 %), and increased during gonadal development (4.90 - 34.59 %) to decrease after spawning. During vitellogenesis, there was a mobilization of n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) from the liver. Percentage of total saturated fatty acids deposits, mainly of palmitic acid (16:0), and of PUFA, mainly of eicosapentaenoic (EPA), docosahexaenoic (DHA), and arachidonic (ARA) acids, significantly decreased in the ovaries. Contrarily, mono-unsaturated fatty acids, principally of palmitoleic acid (16:1) and heptadecenoic acid (17:1), which is of bacterial origin, significantly increased. The study of the behavioural responses to pellets (2, 4, 6, 8 mm diameter) and the preferred feeding area indicated that optimal pellet diameters for juveniles (~ 360 g) were 2 and 4 mm, while for adults (~ 930 g) was 4 mm, and that flathead grey mullet preferred to feed in the water column and the bottom rather than in the surface. Long-term treatment with weekly injections of single-chain recombinant follicle- stimulating hormone (rFsh) (4 to 15 µg kg-1 doses) and /or recombinant luteinizing- hormone (rLh) (2.5 to 24 µg kg-1 doses) produced in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells induced and completed vitellogenesis in 100 % of females (n = 29) that received the complete treatment. The 100 % of males (n = 13) spermiated. Priming dose of 30 µg kg- 1 rLh induced oocyte maturation 24 h after administration. Resolving dose of 40 mg kg-1 Progesterone (n = 9 females) and 30 µg kg-1 rLh (n = 6) resulted in 89 % and 100 % spawning success, respectively, with 63 ± 21 % fertilization and 58 ± 23 % hatching. The differential expression of genes and enriched molecular pathways amongst different stages of vitellogenesis induced with the rFsh and rLh treatment, after RNA-Seq and de novo transcriptome assembly, were typical of natural oogenesis reported for other fish species. The findings from this thesis have permitted to control the reproduction of flathead grey mullet in intensive culture conditions, and raise the possibility of using the rFsh and rLh treatment to develop out-of-season spawning and apply it in other species that present similar reproductive disorders.