Efectes a curt termini de nanoplàstics en peixos: anàlisi de l'expressió gènica i marcadors bioquímics en espècies model| Efectos a corto plazo de nanoplásticos en peces: análisis de expresión génica y marcadores bioquímicos en especies modelo| Short-term effects of nanoplastics in fish: analysis of gene expression and biochemical endpoints in model species|

Abstract

La contaminació per plàstic és una preocupació ecològica actual, que està rebent creixent atenció per part de la societat, la comunitat científica i els governs. La major part de la contaminació plàstica és causada per petits fragments de plàstic, els microplàstics i nanoplàstics (NP), actualment considerats contaminants emergents. La disminució de la mida de les partícules de plàstic augmenta la biodisponibilitat i els possibles efectes nocius que aquestes poden tenir sobre els organismes. Tot i que el medi aquàtic està especialment en risc de contaminació per NP, actualment es coneix poc sobre els seus potencials efectes tòxics, especialment en organismes de nivells tròfics alts com els peixos. A més, fins ara pocs estudis han tractat els efectes dels NP sobre espècies de peixos marines d’interès per a l’aqüicultura marina. Els estudis que s’han dut a terme durant en aquesta tesi investiguen l’ecotoxicologia dels NP utilitzant peixos com a models vertebrats. Per tal d’entendre millor l’absorció i els efectes dels NP en els peixos, individus de les especies Danio rerio (peix zebra), Sparus aurata (orada) i Dicentrarchus labrax (llobarro) han sigut exposats a NP, per a avaluar respostes a curt termini en l’expressió de gens i marcadors bioquímics relacionats amb el metabolisme, l’ estrés oxidatiu i el sistema immune. En peix zebra, s’han estudiat hepatòcits (cèl·lules ZFL) com a model in vitro, trobant acumulació de nanoplàstics de poliestirè (PS-NPs) als lisosomes, juntament amb alteracions en l’expressió de gens antivirals en resposta a poly(I:C). En larves de peix zebra també s’hi acumulen PS-NP, principalment a intestí i pàncrees, però l’exposició a PS-NP no va afectar la supervivència de les larves a una infecció per Aeromonas hydrophila. En orada, l’exposició a curta (96 h) a través de l’aigua a nanoplàstics de polimetilmetacrilat (PMMA-NP) provoca estrès oxidatiu i inflamació lleu a les tres barreres mucoses que actuen com a portals d’entrada de NPs en peixos (pell, brànquies i intestí), amb l’intestí com a teixit més afectat. Al fetge no es va trobar cap resposta inflamatòria i només una lleu resposta d’estrès oxidatiu. Tot i no trobar una resposta pronunciada d’estrès oxidatiu, es van observar efectes genotòxics als eritròcits de S. aurata. El metabolisme lipídic és la via molecular més afectada al fetge, segons els resultats de l’expressió gènica i paràmetres bioquímics. En el múscul, s’ha obervat una resposta antiinflamatòria transitòria, sense efectes immediats a curt termini sobre el creixement i la diferenciació muscular. En llobarro, l’exposició (96 h) a PMMANP va alterar els gens relacionats amb el metabolisme dels lípids, mentre que no es van trobar canvis importants en els paràmetres bioquímics avaluats. Considerant els resultats en conjunt, trobem que hi ha canvis rellevants tant en les vies moleculars com en els paràmetres bioquímics relacionats amb el metabolisme dels lípids i l’estrès oxidatiu. També s’ha trobat una lleu activació de les respostes inflamatòries i immunes; tanmateix, els mecanismes d’acció i els efectes específics en diferents teixits i espècies s’han d’investigar més a fons. Avaluant globalment tots els estudis presentats en aquesta tesi i valorant l’efecte de la concentració de NPs, trobem que les concentracions d’exposició més baixes semblen ser les que causen més efectes potencials. Això suggereix que una dosi-resposta no monotònica i efectes a dosis baixes són un possible escenari en la toxicologia de NPs. Globalment, els estudis presentats en aquesta tesi contribueixen a augmentar el coneixement en el camp de l’ecotoxicologia de NPs en peixos.

La contaminación por plástico es una preocupación ecológica actual, que está recibiendo creciente atención por parte de la sociedad, la comunidad científica y los gobiernos. La mayor parte de la contaminación plástica es causada por pequeños fragmentos de plástico, los microplásticos y nanoplásticos (NP), actualmente considerados contaminantes emergentes. La disminución del tamaño de las partículas de plástico aumenta la biodisponibilidad y los posibles efectos nocivos que éstas pueden tener sobre los organismos. Aunque el medio acuático está especialmente en riesgo de contaminación por NP, actualmente se conoce poco sobre sus potenciales efectos tóxicos, especialmente en organismos de niveles tróficos altos como los peces. Además, hasta ahora pocos estudios han tratado los efectos de los NP sobre especies de peces marinas de interés para la acuicultura marina. Los estudios que se han llevado a cabo durante esta tesis investigan la ecotoxicología de los NP utilizando peces como modelos vertebrados. Por para entender mejor la absorción y los efectos de los NP en los peces, individuos de las especies Danio rerio (pez cebra), Sparus aurata (dorada) y Dicentrarchus labrax (lubina) han sido expuestos a NP, para evaluar respuestas a corto plazo en la expresión de genes y marcadores bioquímicos relacionados con el metabolismo, el estrés oxidativo y el sistema inmune. En pez cebra, se han estudiado hepatocitos (células ZFL) como modelo in vitro, encontrando acumulación de nanoplásticos de poliestireno (PS-NPs) en los lisosomas, junto con alteraciones en la expresión de genes antivirales en respuesta a poly(I:C). En larvas de pez cebra también se acumulan PS-NP, principalmente en intestino y páncreas, pero la exposición a PS-NP no afectó a la supervivencia de las larvas a una infección por Aeromonas hydrophila. En dorada, la exposición a corta (96 h) en a través del agua a nanoplásticos de polimetilmetacrilato (PMMA-NP) provoca estrés oxidativo e inflamación leve en las tres barreras mucosas que actúan como portales de entrada de NPs en peces (piel, branquias e intestino), con el intestino como a tejido más afectado. En el hígado no se encontró ninguna respuesta inflamatoria y sólo una leve respuesta de estrés oxidativo. A pesar de no encontrar una respuesta pronunciada de estrés oxidativo, se observaron efectos genotóxicos en los eritrocitos de S. aurata. El metabolismo lipídico es la vía molecular más afectada en el hígado, según los resultados de la expresión génica y parámetros bioquímicos. En el músculo, se ha observado una respuesta antiinflamatoria transitoria, sin efectos inmediatos a corto plazo sobre el crecimiento y la diferenciación muscular. En lubina, la exposición (96 h) en PMMANP alteró los genes relacionados con el metabolismo de los lípidos, mientras que no se hallaron cambios importantes en los parámetros bioquímicos evaluados. Considerando los resultados en conjunto, encontramos que hay cambios relevantes tanto en las vías moleculares como en los parámetros bioquímicos relacionados con el metabolismo de los lípidos y el estrés oxidativo. También se ha encontrado una leve activación de las respuestas inflamatorias e inmunes; sin embargo, los mecanismos de acción y los efectos específicos en diferentes tejidos y especias deben investigarse más a fondo. Evaluando globalmente todos los estudios presentados en esta tesis y valorando el efecto de la concentración de NPs, encontramos que las concentraciones de exposición más bajas parecen ser las que causan mayores efectos potenciales. Esto sugiere que una dosis-respuesta no monotónica y efectos a dosis bajas son un posible escenario en la toxicología de NPs. Globalmente, los estudios presentados en esta tesis contribuyen a aumentar el conocimiento en el campo de la ecotoxicología de NPs en peces.

Plastic pollution is a major ecological concern that is receiving increasing attention from the general public, the scientific community and governments. The bulk of plastic pollution is mainly caused by small plastic fragments, microplastics and nanoplastics (NPs), currently considered widespread contaminants of emerging concern. The decrease in plastic particle size increases the bioavailability and the potential harmful effects that these particles have on organisms. The aquatic environment is particularly at risk of exposure NPs, yet there is currently little known about their potential toxic effects, specifically in organisms of higher trophic levels such as fish. To date, few studies have addresses the effects of NPs on marine aquaculture fish species. The studies that were conducted during this work sought to investigate the ecotoxicology of NPs using fish as a vertebrate model. In order to gain a better understanding of the uptake and effects of NPs in fish, Danio rerio (zebrafish), Sparus aurata (gilthead seabream) and Dicentrarchus labrax (European seabass) individuals were exposed to NPs to assess the short-term responses of metabolic, oxidative and immune-related genes and biochemical endpoints. In zebrafish, hepatocytes (ZFL cells) were examined as an in vitro model, and accumulation of polystyrene nanoplastics (PS-NPs) was found in lysosomes, together with an altered expression of antiviral genes in response to poly(I:C). Zebrafish larvae also accumulated PS-NPs, mainly in gut and pancreas, but the exposure to PS-NPs did not affect larvae the survival to Aeromonas hydrophila infection. In gilthead seabream, a short-term (96h) waterborne exposure to polymethylmethacrylate nanoplastics (PMMA-NPs) caused oxidative stress and mild inflammation in the three mucosal barriers that act as portals of entry of NPs in fish (skin, gills and intestine), with intestine as the most affected tissue. In liver no inflammatory response was found and only a mild oxidative stress response. Despite finding no pronounced oxidative stress response, genotoxic effects were observed in S. aurata erythrocytes. Lipid metabolism is suggested as the most affected molecular pathway in liver, as shown by gene expression and biochemistry results. In muscle, a transient anti-inflammatory response was noted and no immediate short-term effects on muscle growth and differentiation. In European seabass, exposure (96h) to PMMA-NPs altered transcripts related to lipid metabolism, while no major changes were found in the assessed biochemical parameters. Taking all results together, we can say that there are relevant changes both in the molecular pathways and biochemical parameters related to lipid metabolism and oxidative stress. Low-level activation of inflammatory and immune responses was also found; however, mechanisms of action and tissue and species-specific effects should be further investigated. Globally looking at all the studies presented in this thesis and assessing the NPs’ concentration effect, we find that the lower exposure concentrations appear to be the ones causing more potential effects. This suggests that a non-monotonic dose response and low-dose effects are a plausible scenario in NPs toxicology. Altogether, the studies presented in this thesis contribute to increase knowledge in the field of NPs’ ecotoxicology.