G1-Cdk modulation by time and stress

Abstract

The cell cycle is regulated at different layers of control in either homeostatic or non-homeostatic conditions. Hence, in this work we analyse how time and stress modulate the cell cycle through the activity of the G1 Cdk. Cell growth and division are coordinated processes that ensure life perpetuation with optimal cell fitness. One fundamental trait that emerges from this interplay is cell size. Despite being a seemingly basic attribute, little is known about the molecular machinery that ensures a homeostatic cell size control. In budding yeast, cell size control is mostly established in G1 and relies on the machinery that regulates the Start checkpoint transition. It is at this point where the G1 Cdk, formed by the Cdc28 Cdk and cyclin Cln3, promotes the inhibitory phosphorylation of the Whi5 repressor at the same time that activates the function of RNA polymerase II at specific SBF/MBF loci. Three models have been proposed to orchestrate these factors in size control: sizers, timers, and adders. So far, cell size control has been reported to be exerted through the dilution of Whi5 repressor acting as sizer. Even so, cell size still depicts high single-cell variability and

thus warms the debate about a stochastic or deterministic size control. Favouring the latter, our work adds a time- dependent control layer executed by the interplay of APCCdh1, the mitotic-exit protein-degradation machine, Mad3, a

centromeric-signalling protein, and Cln3, the G1 cyclin. APCCdh1 is activated during exit from the previous mitosis and degrades Mad3 decreasing its protein levels as cells progress through G1. At the same time, since Mad3 actively participates in the degradation of Cln3 by SCF, levels of active G1 Cdk increase in the nucleus throughout G1 until Start, where cells become committed to enter the next cell cycle. Our model bestows a timer control in G1 emerging from the intertwined coordination of APC and SCF degradation machineries. Aside of its role in the cell cycle, here we show that the G1 Cdk is also an active regulator of cell fitness under stress conditions. Many strategies conform the so-called stress response and its adaptation to a wide range of stresses and intensities. Among them, the rapid formation of stress granules (SGs) upholds cell survival and growth recovery to optimal

levels upon stress relief. Stress granules are membraneless condensates rich in translationally-inhibited mRNAs and RNA- binding proteins. Their internal multivalent interactions settle a proper thermodynamic environment that generates the

formation of protein-RNA assemblies by liquid-liquid phase separation. Among the diverse transcriptome and proteome composition of SGs, we have found Whi8 as a key element that connects the stress response to the cell cycle control machinery. Whi8 modulates the budding volume and interacts with both the CLN3 mRNA and the Cdc28 kinase. Interestingly, Whi8 is also a bona fide component of SGs that recruits Cdc28 and the CLN3 mRNA into these condensates. The consequence of this recruitment directly influences on both the kinetics of SG dissolution and the inactivation of the yeast Cdk. Our results designate Caprin1 as the mammalian functional homolog of Whi8 that interacts with Cdk4 and the mRNA of cyclin D1. In summary, the G1 Cdk favours disassembly of stress granules which, in turn, inhibit the activity of the Cdk. This mutual inhibition relationship generates a bistable system that ensures a rapid and abrupt SG formation only when stress exceeds a level that would otherwise endanger cell viability.

El cicle cel·lular regula diferents nivells de control tant en condicions homeostàtiques com no homeostàtiques. En aquest treball analitzem com el temps i l'estrès modulen el cicle cel·lular a través de l'activitat de la Cdk de G1. El creixement cel·lular i la divisió són processos coordinats que asseguren la perpetuació de la vida amb una adaptació òptima. Un tret fonamental que sorgeix d'aquesta interacció és la mida de la cèl·lula. Tot i ser un atribut aparentment bàsic, es coneix poc sobre la maquinària molecular que assegura un control de la mida de la cèl·lula homeostàtica. En el llevat de gemmació, el control del tamany cel·lular s'estableix principalment en G1 i es basa en la maquinària que regula la transició del punt de control d’Start. És en aquest punt on el complex format per la Cdk Cdc28 i la ciclina Cln3 promou la fosforilació inhibidora del repressor Whi5 al mateix temps que activa la funció de l'ARN polimerasa II en el loci SBF/MBF. S'han proposat tres models que poden executar aquests factors per controlar el tamany cel·lullar: “sizers”, “timers” i “adders”. Fins ara, el repressor transcripcional Whi5 ha estat reportat com modulador del control del volum de la cèl·lula a travès de la seva dilució. Tot i així, la mida cel·lular encara mostra una gran variabilitat a nivell de cèl·lula única i ,per tant, això escalfa el debat sobre si el control de la mida és estocàstic o determinista. Afavorint aquesta darrera opció, el nostre treball afegeix un nivell de control dependent del temps i executat per la interacció de l’APCCdh1 (la màquina de degradació de proteïnes de sortida mitòtica), Mad3 (una proteïna de senyalització centromèrica) i Cln3, la ciclina de G1. L'APCCdh1 s'activa durant la sortida de la mitosi anterior i degrada Mad3 reduint els seus nivells a mesura que les cèl·lules progressen en G1. Al mateix temps, donat que Mad3 participa activament en la degradació de Cln3 per SCF, els nivells de Cdk actiu augmenten en el nucli durant G1 fins a Start, on les cèl·lules estableixen l’entrada en el següent cicle cel·lular. El nostre model proporciona un control de temps en G1 que sorgeix de la coordinació entrellaçada de les màquines de degradació APC i SCF. A més del seu paper en el cicle cel·lular, hem demostrat que la Cdk de G1 també és un regulador actiu de la supervivència cel·lular en condicions hostils. Moltes estratègies conformen l'anomenada resposta a estrès i la seva adaptació a diferents tipus d'estrès i intensitat. Entre ells, la ràpida formació de grànuls d'estrès manté la supervivència cel·lular i la recuperació del creixement a nivells òptims post-estrès. Els grànuls de l'estrès són condensats sense membrana rics en ARN missatgers (ARNm) no traduïts i proteïnes d'unió a l'ARN. Les seves interaccions internes multivalents s'estableixen en un entorn termodinàmic adequat que facilita associacions de proteïna-ARN que genera separació de fase líquida. Entre la diversa composició transcriptòmica i proteòmica dels grànuls d’estrès, hem trobat Whi8 com un element clau que connecta la resposta d'estrès amb la maquinària de control del cicle cel·lular. Whi8 modula el volum de gemmació i interacciona tant amb l'ARN missatger de CLN3 com amb la Cdk Cdc28. Curiosament, Whi8 és també un component canònic de grànuls d’estrès que recluta Cdc28 i el mRNA de CLN3 en aquests condensats. La conseqüència d'aquest reclutament influeix directament en la cinètica de la dissolució dels grànuls d’estrès i la inactivació de la Cdk de llevat. Paral·lelament, els nostres resultats designen Caprin1 com l'homòleg funcional de Whi8 en mamífer ja que interacciona amb Cdk4 i l'ARNm de la ciclina D1. En resum, la Cdk de G1 afavoreix la dissolució dels grànuls d'estrès que, al seu torn, inhibeixen l'activitat de la Cdk. Aquesta relació d'inhibició mútua genera un sistema biestable que assegura una formació ràpida i abrupta dels grànuls d’estrès només quan aquest supera un nivell que podria posar en perill la viabilitat cel·lular.