Discovery of synthetic lethal or viable interactions between DNA repair pathways

Abstract

Les cèl·lules de mamífer han desenvolupat rutes de reparació de l’ADN per protegir el material genètic de mutacions que podrien provocar càncer o mort cel·lular. Cada ruta de reparació de l’ADN respon a un tipus específic de dany. La ruta de reparació Fanconi/BRCA corregeix els enllaços creuats entre cadenes d’ADN que provoquen trencaments de doble cadena altament perjudicials si no es reparen. Mutacions als gens que constitueixen aquesta ruta de reparació causen una malaltia rara anomenada anemia de Fanconi. Els pacients amb aquesta malaltia tenen un alt risc de patir fallada medul·lar i càncer. Les proteïnes de la ruta FA/BRCA es classifiquen dins de tres grans grups: un primer grup la principal funció del qual és la ubiquitinació del complex FANCD2-I, el complex FANCD2-I que un cop monoubiquitinat recluta proteïnes al lloc del dany i un últim grup format per les proteïnes reclutades al lloc del dany que són les encarregades de la reparació de lenllaç creuat. La reparació es produirà per l’eliminació de l’enllaç creuat, la síntesi translesió i la reparació del trencament de doble cadena via recombinació homòloga. La letalitat sintètica es fa servir en el tractament del càncer per eliminar específicament les cèl·lules canceroses. Aquesta letalitat es produeix per la inhibició de dos gens que condueix a la mort cel·lular, mentre que la inhibició únicament d’un d’ells no afecta la viabilitat. D’altra banda, la resistència a fàrmacs d’algunes cèl·lules tumorals pot ser deguda a un procés on la inhibició d’un gen fa viable una cèl·lula que no ho era per la inhibició d’un altre gen. Aquest procés s’anomena viabilitat sintètica. Una aplicació de la letalitat sintètica es troba en el tractament amb inhibidors de la PARP del càncer de mama o d’ovari amb deficiència en gens BRCA. Els gens FA es troben freqüentment mutats en tumors i, fins ara, només hi ha descrites algunes interaccions letals sintètiques a la ruta FA, cosa que obre la possibilitat d’explorar en aquesta ruta la letalitat sintètica per el tractament del càncer. L’objectiu de la tesi va ser trobar interaccions sintètiques letals o viables entre les proteïnes FANCA i FANCD2 i altres rutes de reparació de l’ADN. Per això es va desenvolupar l’assaig de competència de color que detecta la letalitat o la viabilitat sintètica mitjançant citometria de flux. Amb el mètode CRISPR/Cas9, es van generar clons knock-out per a FANCA i FANCD2 i es van fer servir amb shRNA per silenciar un segon gen en una ruta de reparació de l’ADN. A més, es van fer servir línies cel·lulars comercials o de pacients amb knock-outs coneguts en gens d’altres vies de reparació de l’ADN i es van tractar amb shRNA per provar la letalitat o la viabilitat sintètica amb FANCA o FANCD2. En aquesta tesi amb l’assaig de competició de color, no s’ha detectat cap interacció letal sintètica nova. Tanmateix, sí que s’han detectat dues noves interaccions de viabilitat sintètica; una entre FANCA i FEN1 i una segona entre FANCA i dues proteïnes de la via NER, XPA i XPF. Aquest descobriment podria donar lloc a possibles aplicacions terapèutiques al tractament de l’anèmia de Fanconi.

Las células de mamífero han desarrollado rutas de reparación del ADN para proteger el material genético de mutaciones que podrían provocar cáncer o muerte celular. Cada ruta de reparación del ADN responde a un tipo específico de daño. La ruta de reparación Fanconi/BRCA corrige los enlaces cruzados entre cadenas de ADN que provocan roturas de doble cadena altamente perjudiciales si no se reparan. Mutaciones en los genes que constituyen dicha ruta de reparación causan una enfermedad rara llamada anemia de Fanconi. Los pacientes con dicha enfermedad tienen un alto riesgo de padecer fallo medular y cáncer. Las proteínas de la ruta FA/BRCA se clasifican dentro de tres grandes grupos: un primer complejo cuya principal función es la ubiquitinación del complejo FANCD2-I, el complejo FANCD2-I que una vez monoubiquitinado recluta proteínas al lugar del daño y un último complejo formado por las proteínas reclutadas al lugar del daño que son las encargadas de la reparación del enlace cruzado. La reparación se producirá por la eliminación del enlace cruzado, la síntesis translesión y reparación de la rotura de doble cadena vía recombinación homóloga. La letalidad sintética se utiliza en el tratamiento del cáncer para eliminar específicamente las células cancerosas. Dicha letalidad se produce por la inhibición de dos genes que conduce a la muerte celular, mientras que la inhibición única de uno de ellos no afecta a la viabilidad. Por otro lado, la resistencia a fármacos de algunas células tumorales puede ser debida a un proceso en el cual la inhibición de un gen hace viable una célula que no lo era por la inhibición de otro gen. Dicho proceso se denomina viabilidad sintética. Una aplicación de la letalidad sintética se encuentra en el tratamiento con inhibidores de PARP del cáncer de mama o de ovario con deficiencia en genes BRCA. Los genes FA se encuentran frecuentemente mutados en tumores y, hasta el momento, sólo hay descritas algunas interacciones letales sintéticas en la ruta FA, lo que abre la posibilidad de explorar en esta ruta la letalidad sintética para el tratamiento del cáncer. El objetivo de la tesis fue encontrar nuevas interacciones sintéticas letales o viables entre las proteínas FANCA y FANCD2 y otras rutas de reparación del ADN. Para ello se desarrolló el ensayo de competencia de color que detecta la letalidad o viabilidad sintética mediante citometría de flujo. Con el método CRISPR/Cas9, se generaron clones knock-out para FANCA y FANCD2 y se usaron con shRNA para silenciar un segundo gen en una ruta de reparación del ADN. Además, se emplearon líneas celulares comerciales o de pacientes con knock-outs conocidos en genes de otras vías de reparación del ADN y se trataron con shRNA para probar la letalidad o la viabilidad sintética con FANCA o FANCD2. En esta tesis con el ensayo de competición de color no se ha detectado ninguna interacción letal sintética nueva. Sin embargo, sí se han detectado dos nuevas interacciones de viabilidad sintética; una entre FANCA y FEN1 y una segunda entre FANCA y dos proteínas de la vía NER, XPA y XPF. Este descubrimiento podría dar lugar a posibles aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de la anemia de Fanconi.

Mammalian cells have developed a set of DNA repair pathways to protect the genomic information from mutations that could lead to cancer or cell death. Each DNA repair pathway responds to a specific kind of DNA damage. The Fanconi/BRCA pathway is one of these specialized and highly important DNA repair networks correcting interstrand cross-links that would lead to highly toxic double strand breaks if left unrepaired. Mutations in the Fanconi/BRCA pathway cause a rare blood and cancer susceptibility disease called Fanconi Anaemia. The concept of synthetic lethality is used in cancer treatment to kill specifically cancer cells. Synthetic lethality refers to the inhibition/deficiency of two gene products that leads to cell death while inhibition of either one alone does not affect viability. The treatment of BRCA-deficient breast and ovarian cancers with PARP inhibitors is an application of this concept, which proved successful in clinical trials. Fanconi genes are found regularly mutated in cancer and so far, there are a few described synthetic lethal interactions in the Fanconi pathway, which opens the possibility of exploiting this synthetic lethality for cancer treatment. The term “synthetic viability” instead, refers to a genetic interaction in which a cell that is non-viable, sensitive to a specific drug, or altered due to the presence of a genetic mutation, becomes viable with a second mutation in a different gene. The objective of the thesis was to find novel synthetic lethal or viable interactions between the Fanconi proteins FANCA and FANCD2 and other DNA repair pathways. For this a method was developed, the colour competition assay that detects synthetic lethality or viability by cytometer measurement. With the CRISPR/Cas9 method knock-out clones for FANCA and FANCD2 were generated and used with shRNA for silencing a second gene in a DNA repair pathway. Additionally, commercial or patient cell lines with known knock-outs in genes of other DNA repair pathways were employed and treated with shRNA to test for synthetic lethality or viability with FANCA or FANCD2. The colour competition assay could not discover any novel synthetic lethal interaction, it revealed a synthetic viability interaction between FANCA and FEN1 that and a second synthetic viability between FANCA and two proteins of the NER pathway, XPA and XPF. This discovery could lead to potential therapeutic applications in Fanconi anaemia treatment.