Caracterización epigenética de la heterogeneidad intratumoral espacial y temporal. comparativa entre tumor primario y metástasis hepáticas de cáncer colorectal

Abstract

Introducció: Durant el procés de carcinogènesi del CCR, hi ha una acumulació progressiva d’alteracions genètiques i epigenètiques a la transició teixit normal-adenoma-adenocarcinoma. A partir d’aquestes, ha estat possible establir un consens de diferents subtipus tumorals i on es posa de manifest l’heterogeneïtat tumoral del CCR. A nivell clínic, només disposem en el moment actual de la mutació a RAS, com a factor de selecció de tractament, per la qual cosa globalment tractem els pacients de CCR de forma homogènia, però el seu pronòstic és molt variable, probablement per la pròpia heterogeneïtat que aquesta neoplàsia presenta. En aquest treball es pretén valorar l'ús de l'epigenètica com a eina diferenciadora de l'heterogeneïtat tumoral. Primer, analitzant l’heterogeneïtat intratumoral espacial, determinant epigenèticament quines són les regions del tumor més divergents, i posteriorment estudiant l’heterogeneïtat intertumoral i intratumoral temporal, definint les regions del tumor que són més similars a la metàstasi apariada. Metodologia: Es van reclutar mostres de teixit inclòs en parafina de 79 pacients amb CCR, incloent 23 casos amb metàstasis hepàtiques apariades, des de 1990 fins a 2012, procedents de H. Germans Trias i Pujol i de l’H. Valle Hebrón. Es van incloure de manera retrospectiva havent signat el consentiment informat. Al Servei d’Anatomia Patològica es va realitzar la delimitació de les regions a estudi, per a una macrodissecció posterior, i per a l’anàlisi de característiques histopatològiques de les mostres. L’anàlisi dels perfils de metilació de l’ADN es va realitzar mitjançant la tecnologia de microarrays d’Illumina, i l’anàlisi de dades mitjançant l’entorn estadístic R. L’anàlisi estadística de les variables clinicopatològiques i moleculars es va fer mitjançant el programari SPSS. Resultats: Breument, les característiques clinicopatològiques i moleculars de la cohort d’estudi van ser: edat major de 60 anys en un 60%, malaltia localitzada en un 80%, localització còlon esquerre en un 60%, MSI 14%, fenotip MSI i mutació a BRAF en un 14%, KRAS mutat en un 29%. Es van delimitar 3 regions intratumorals: una de més propera al tracte digestiu (TS), una massa tumoral central (CB) i el front invasor (IF). Es va analitzar el perfil de metilació de cada regió en cada pacient, mostrant diferències estadísticament significatives en només un 9% de posicions CpG analitzades, sent l’heterogeneïtat intertumoral més gran que la intratumoral, així com l’IF de la regió intratumoral més epigenèticament diferent en un 49 % dels casos. A partir de la conversió quantitativa del nivell d’heterogeneïtat intratumoral mitjançant la generació d’un coeficient, es va determinar una associació significativa amb el pronòstic de la malaltia en aquesta cohort, i els casos més homogenis són els que presenten un pronòstic més pobre. Finalment, en el context de l’heterogeneïtat intratumoral temporal, observem que la regió intratumoral del tumor primari més epigenèticament semblant a la seva metàstasi aparellada era la TS. Conclusions: Hi ha l’heterogeneïtat intratumoral a nivell epigenètic, i el front invasor és la regió més epigenèticament diferent. L’heterogeneïtat intratumoral es presenta en només un 9% de posicions interrogades, i és menor que la intertumoral, però els seus nivells tenen un paper com a factor pronòstic en aquesta cohort. La regió intratumoral que presenta més similitud epigenètica amb la seva metàstasi aparellada és la TS, hipotetitzant que l’extravasació metastàtica es podia donar en fases primerenques de la progressió tumoral.

Introducción: Durante el proceso de carcinogénesis del CCR, hay una acumulación progresiva de alteraciones genéticas y epigenéticas en la transición tejido normal-adenoma-adenocarcinoma. A partir de éstas, ha sido posible establecer un consenso de diferentes subtipos tumorales, y dónde se pone de manifiesto la heterogeneidad tumoral del CCR. A nivel clínico, sólo disponemos en el momento actual de la mutación en RAS, como factor de selección de tratamiento, por lo que globalmente tratamos a los pacientes de CCR de forma homogénea, pero su pronóstico es muy variable, probablemente por la propia heterogeneidad que esta neoplasia presenta. En este trabajo se pretende valorar el uso de la epigenética como herramienta diferenciadora de la heterogeneidad tumoral. Primero, analizando la heterogeneidad intratumoral espacial, determinando epigenéticamente cuáles son las regiones del propio tumor más divergentes, y posteriormente estudiando la heterogeneidad intertumoral e intratumoral temporal, definiendo las regiones del tumor que son más similares a la metástasis pareada. Metodología: Se reclutaron muestras de tejido incluido en parafina de 79 pacientes con CCR, incluyendo 23 casos con metástasis hepáticas pareadas, desde 1990 hasta 2012, procedentes de H. Germans Trias i Pujol y del H. Valle Hebrón. Se incluyeron de forma retrospectiva habiendo firmado el consentimiento informado. En el Servicio de Anatomía Patológica se realizó la delimitación de las regiones a estudio, para una posterior macrodisección, y para el análisis de características histopatológicas de las muestras. El análisis de los perfiles de metilación del ADN se realizó mediante la tecnología de microarrays de Illumina, y el análisis de datos mediante el entorno estadístico R. El análisis estadístico de las variables clínico-patológicas y moleculares se realizó mediante el software SPSS. Resultados: Brevemente, las características clínico-patológicos y moleculares de la cohorte de estudio fueron: edad mayor de 60 años en un 60%, enfermedad localizada en un 80%, localización colon izquierdo en un 60%, MSI 14%, fenotipo MSI y mutación en BRAF en un 14%, KRAS mutado en un 29%. Se delimitaron 3 regiones intratumorales: una más cercana al tracto digestivo (TS), una masa tumoral central (CB) y el frente invasor (IF). Se analizó el perfil de metilación de cada región en cada paciente, mostrando diferencias estadísticamente significativas en solamente un 9% de posiciones CpG analizadas, siendo la heterogeneidad intertumoral mayor que la intratumoral, así como el IF de la región intratumoral más epigenéticamente diferente en un 49% de los casos. A partir de la conversión cuantitativa del nivel de heterogeneidad intratumoral mediante la generación de un coeficiente, se determinó una asociación significativa con el pronóstico de la enfermedad en esta cohorte, siendo los casos más homogéneos, los que presentan un pronóstico más pobre. Por último, en el contexto de la heterogeneidad intratumoral temporal, observamos que la región intratumoral del tumor primario más epigenéticamente parecida a su metástasis pareada era la TS. Conclusiones: Existe la heterogeneidad intratumoral a nivel epigenético, siendo el frente invasor la región más epigenéticamente diferente. La heterogeneidad intratumoral se presenta en solamente un 9% de posiciones interrogadas, y es menor que la intertumoral, pero sus niveles tienen un papel como factor pronóstico en la presente cohorte. La región intratumoral que presenta mayor similitud epigenética con su metástasis pareada es la TS, hipotetizando que la extravasación metastásica se podía dar en fases tempranas de la progresión tumoral.

Introduction: During the carcinogenesis process of CRC, there is a progressive accumulation of genetic and epigenetic alterations in the normal tissue-adenoma-adenocarcinoma transition. Based on these, it has been possible to establish a consensus of different tumor subtypes, and where the tumor heterogeneity of CRC is revealed. At the clinical level, nowadays only mutations in RAS are used as treatment selection factor, so globally CRC patients are homogeneously treated, though their prognosis is highly variable, probably due to the heterogeneity that this neoplasia presents. In thiswork we want to assess the use of epigenetics as a differentiating tool for tumor heterogeneity, firstly analyzing spatial intratumoral heterogeneity, secondly determining epigenetically which are the most divergent regions of the tumor itself, and later studying intertumoral and temporal intratumoral heterogeneity, defining the regions of the tumor that are most similar to paired metastasis. Methodology: Paraffin-embedded tissue samples were recruited from 79 CRC patients, including 23 cases with paired liver metastases, from 1990 to 2012, from H. Germans Trias i Pujol and H. Valle Hebron. They were included retrospectively, having signed the informed consent. In the Pathological Anatomy Service, the delimitation of the study regions was carried out, for a subsequent macrodissection, and for the analysis of histopathological characteristics of the samples. Analysis of DNA methylation profiles was performed using Illumina microarray technology, and data analysis using R statistical environment. Statistical analysis of clinicopathological and molecular variables was performed using SPSS software. Results: Briefly, the clinical-pathological and molecular characteristics of the study cohort were: 60% age older than 60 years, 80% localized disease, 60% left colon localization, MSI 14%, MSI phenotype and mutation in BRAF by 14%, KRAS mutated by 29%. 3 intratumoral regions were delimited: one closer to the digestive tract (TS), a central tumor mass (CB) and the invasive front (IF). The methylation profile of each region was analyzed in each patient, showing statistically significant differences in only 9% of the CpG positions analyzed, intertumoral heterogeneity being greater than intratumoral, as well as the IF of the intratumoral region more epigenetically different by 49 % of the cases. From the quantitative conversion of the level of intratumoral heterogeneity through the generation of a coefficient, a significant association with the prognosis of the disease in this cohort was determined, with the most homogeneous cases being those with a poorer prognosis. Finally, in the context of temporal intratumoral heterogeneity, we observed that the intratumoral region of the primary tumor most epigenetically similar to its paired metastasis was the TS. Conclusions: There is intratumoral heterogeneity at the epigenetic level, with the invasive front being the most epigenetically different region. The intratumoral heterogeneity is present in only 9% of the interrogated positions, and it is lower than the intertumoral heterogeneity, but its levels have a role as a prognostic factor in the present cohort. The intratumoral region that presents the greatest epigenetic similarity with its paired metastasis is the TS, hypothesizing that metastatic extravasation could occur in the early stages of tumor progression.