Modelling the extracellular environment of pancreatic ductal adenocarcinoma to study different aspects of disease progression

Abstract

L’adenocarcinoma ductal pancreàtic (ADP) és la malaltia pancreàtica més rellevant, que representa més del 90% de totes les patologies pancreàtiques. L’ADP és la quarta causa més comuna de mort per càncer a Europa i els Estats Units, amb una taxa de supervivència de 5 anys de només el 10%. Una de les característiques més importants de l’ADP és la presència d’una matriu extracel·lular molt densa i dura, produïda per cèl·lules estromals, que genera un microambient únic que promou la proliferació cel·lular i la resistència a l’apoptosi induïda per fàrmacs. Durant aproximadament les últimes cinc dècades, els cultius bi-dimensionals (2D) s’han emprat clàssicament per estudiar la biologia cel·lular del càncer. No obstant, s’ha demostrat que en cultius 2D, les cèl·lules queden exposades a un ambient no fisiològic comparat amb els cultius en 3D, que proveeixen una conformació cel·lular, una dimensió i una duresa normals, així com la formació de gradients moleculars. El microambient dels tumors sòlids es recrea millor en cultius 3D, i per tant, aquest tipus de cultiu es considera una alternativa més fisiològica per a estudiar diferents aspectes de la progressió del càncer, com per exemple la capacitat d’angiogènesis, proliferació cel·lular, resistència a apoptosis i resistència a fàrmacs. En aquesta tesis s’han desenvolupat models in vitro 3D per tal d’estudiar diferents aspectes de l’ADP. En concret, l’ambient extracel·lular s’ha deconstruït en tres paràmetres principals: dimensió, duresa i senyals biològiques, i s’ha estudiat el paper de cadascun d’ells en el desencadenament de diferents respostes cel·lulars com per exemple la proliferació, la resistència a fàrmacs i la mecanotransducció de senyals.

Part d’aquesta tesis s’ha centrat en l’estudi del receptor del factor de creixement epitelial (Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR), un receptor de tirosina quinasa que es troba sobre-expressat en l’ADP. Els resultats mostren com el tractament amb erlotinib, un inhibidor de receptors tirosina quinasa, promou la degradació del EGFR en cultius 3D de diferents línies cel·lulars de càncer de pàncrees, però no en cultius 2D. A més, la degradació d’aquest receptor no succeeix en fibroblasts, cèl·lules no tumorals, en cap dels dos tipus de cultius (2D o 3D). Per tant, no només l’erlotinib té un efecte diferent en cèl·lules tumorals i no tumorals, sinó que, a més a més, les cèl·lules responen de manera diferent al fàrmac quan es cultiven en un ambient 3D.

A més, els científics estan progressivament desenvolupant models de cultiu cel·lular per imitar l’augment de duresa associada a aquest tipus de tumors. En aquesta tesi s’ha estudiat la relació entre les cèl·lules tumorals i el seu ambient biomecànic en termes de duresa de la matriu. S’han utilitzat matrius 3D sintètiques i naturals per a analitzar l’efecte de la duresa de la matriu en termes d’activació de la quinasa d’adhesions focals (focal adhesion kinase, FAK), ja que aquesta proteïna és capaç de sentir la duresa de l’ambient i de participar en vies de mecanotransducció de senyals. A més, FAK es troba hiperactivada en molts càncers epitelials, i la seva expressió es correlaciona amb la malignitat i el potencial invasiu dels tumors. Els resultats obtinguts mostren que les matrius sintètiques d’elevada duresa, però no pas les matrius naturals, promouen la regulació negativa de FAK a nivell de proteïna. En conjunt, els resultats ressalten la importància de sistemes de cultiu que siguin capaços de recrear la fisiologia tumoral de manera més acurada, ja que la resposta cel·lular depèn del microambient en el qual es troben les cèl·lules.

El adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) es la enfermedad pancreática más relevante, representando más del 90% de todas las patologías pancreáticas. El ADP es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en Europa y Estados Unidos, con una tasa de supervivencia de 5 años de solo el 10%. Una de las características más importantes del ADP es la presencia de una matriz extracelular muy densa i dura, producida por células estromales, que genera un microambient único que promueve la proliferación celular i la resistencia a la apoptosis inducida por fármacos. Durante aproximadamente las últimas 5 décadas, los cultivos bidimensionales (2D) se han usado clásicamente para estudiar la biología celular del cáncer. No obstante, se ha demostrado que en cultivos 2D, las células quedan expuestas a un ambiente no fisiológico en comparación con los cultivos en 3D, que aportan una conformación celular, dimensionalidad y dureza normales, así como la generación de gradientes moleculares. El microambiente de los tumores sólidos se recrea mejor en cultivos 3D, y por lo tanto, este tipo de cultivo se considera una alternativa más fisiológica para estudiar diferentes aspectos de la progresión del cáncer, como por ejemplo la capacidad de angiogénesis, proliferación celular, resistencia a apoptosis y resistencia a fármacos. En esta tesis se han desarrollado modelos in vitro 3D para estudiar diferentes aspectos del ADP. En concreto, el ambiente extracelular se ha deconstruido en tres parámetros principales: dimensionalidad, dureza y señales biológicas, y se ha estudiado la contribución de cada uno en desencadenar diferentes respuestas celulares como por ejemplo la proliferación, la resistencia a fármacos y la mecanotransducción de señales.

Parte de esta tesis se ha centrado en el estudio del receptor del factor de crecimiento epitelial (Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR), un receptor de tirosina quinasa que se encuentra sobre-expresado en el ADP. Los resultados muestran como el tratamiento con erlotinib, un inhibidor de receptores tirosina quinasa, promueve la degradación del EGFR en cultivos 3D de diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas, pero no en cultivos 2D. Además, la degradación de este receptor no sucede en fibroblastos, células no tumorales, en ninguno de los dos tipos de cultivos (2D o 3D). Por lo tanto, no sólo el erlotinib tiene un efecto diferente en células tumorales y no tumorales y sino que además, las células responden de modo diferente al fármaco cuando se cultivan en un ambiente 3D.

Además, los científicos están progresivamente desarrollando modelos de cultivo celular para imitar el augmento de dureza asociada a este tipo de tumores. En esta tesis, se ha estudiado la relación entre les células tumorales y su ambiente biomecánico en términos de dureza de la matriz. Se han utilizado matrices 3D sintéticas y naturales para analizar el efecto de la dureza de la matriz en términos de activación de la quinasa de adhesiones focales (focal adhesion kinase, FAK), ya que esta proteína es capaz de sentir la dureza del ambiente y participar en vías de mecanotransducción de señales. Además, FAK se encuentra hiperactivada en muchos cánceres epiteliales, y su expresión se correlaciona con la malignidad y el potencial invasivo de los tumores. Los resultados obtenidos muestran que las matrices sintéticas de elevada dureza, pero no las matrices naturales, promueven la regulación negativa de FAK a nivel de proteína. En conjunto, estos resultados destacan la importancia de sistemas de cultivo que puedan recrear la fisiología tumoral de manera más acurada, ya que la respuesta celular depende del microambiente en el cual se encuentran las células.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most relevant pancreatic disease, accounting for more than 90% of all pancreatic malignancies. PDAC is the fourth most common cause of cancer-related deaths in Europe and US, with an extremely low five-year survival rate of around 10%. One of the main hallmarks of PDAC is the presence of a dense and remarkably stiff extracellular matrix produced by stromal cells, which generates a unique microenvironment that fosters sustained cancer cell proliferation and resistance to drug-induced toxicity and apoptosis. During approximately the last five decades, two-dimensional (2D) cell cultures have been classically used to study cancer cell biology. However, it has been widely demonstrated that in 2D cultures cells are exposed to a non-physiological environment as compared to 3D cultures, which provide the normal cellular conformation, matrix dimensionality and stiffness, as well as molecular gradients. The microenvironment of solid tumors is better recreated in 3D cultures, and therefore they are becoming a more physiological alternative to study different aspects of cancer progression such as angiogenesis, sustained proliferation, resistance to apoptosis and drug resistance capacities. In the present thesis, 3D in vitro models to study different aspects of PDAC have been developed. Specifically, the extracellular milieu has been deconstructed in three main parameters, being dimensionality, stiffness and biological signaling, and the contribution of each one in triggering different cell responses such as cell proliferation, drug resistance and signal mechanotransduction has been explored.

Part of this thesis focused on the study of the Epithelial Growth Factor Receptor (EGFR), a well-known tyrosine kinase receptor that is overexpressed in PDAC. Results show that treatment with the tyrosine kinase inhibitor erlotinib promoted EGFR degradation in 3D cultures of PDAC cell lines but not in 2D cultures. Moreover, receptor degradation did not occur in normal fibroblast cells, regardless of culture dimensionality. Therefore, not only erlotinib had a distinct effect on tumor and normal cells but also pancreatic ductal adenocarcinoma cells responded differently to drug treatment when cultured in a 3D microenvironment.

Moreover, researchers are increasingly developing cell culture models to mimic the increased stiffness associated with these kinds of tumors. In this thesis, the relationship between tumor cells and their biomechanical environment in terms of matrix stiffness has been studied. Both synthetic and natural 3D matrices were used to analyze the effect of matrix stiffness in terms of focal adhesion kinase (FAK) activation, as this protein has been widely reported to sense the stiffness of the environment and participate in signal mechanotransduction pathways. In addition, FAK is hyperactivated in many epithelial cancers and its expression correlates with tumor malignancy and invasion potential. Results show that increased matrix stiffness in synthetic but not in natural scaffolds promoted FAK downregulation at a protein level. Altogether, these findings highlight the importance of culture systems that can more accurately mimic the in vivo tumor physiology, since cell response strongly depends on the microenvironment in which they exist.