Advancing cancer precision medicine through cell-based functional assays and microfluidics. Finding the needle in a haystack to improve pediatric leukemia treatment

Abstract

[eng] Personalized medicine has emerged to improve cancer treatment beyond classical approaches. The identification of genetic mutations by molecular analyses dominate personalized medicine initiatives promoting clinical benefit, but they often present limited predictive capacity for treatments. An alternative to these are functional assays, which expose cancer cells to different therapeutic options to identify which will be the most effectives in eliminating the tumor. Although these techniques are less widespread than those based on genetic studies, the first clinical trials using functional assays obtained good results. Even so, there are important limitations to the application of these techniques, including the obtention of sufficient biological material to perform these assays or the deterioration of the primary samples under ex vivo conditions. Dynamic BH3 Profiling (DBP) is a functional assay that allows a rapid prediction of treatment efficacy, thus avoiding sample decline. In this thesis, we focus on finding new effective treatments for pediatric B-cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia (BCP-ALL), especially in the small percentage of patients who relapse after being treated with standard-of-care therapy. Using DBP in in vitro models, we identified cytotoxic chemotherapeutics and targeted therapies after short incubations. In addition, we also detected adaptations conferring resistance to the applied drug mediated by antiapoptotic proteins of the BCL-2 family. These observations pointed to the potential use of BH3 mimetics, specific inhibitors of antiapoptotic proteins already utilized in the clinic, in combination with other anticancer treatments. In our BCP-ALL models we identified antiapoptotic adaptations after treatment using DBP, which helped us to rationally design new combinations of chemotherapeutics or targeted therapies with a specific BH3 mimetic to block the observed adaptation. These new combinations boosted treatment efficacy or allowed a reduction of its concentration while maintaining cytotoxicity. DBP also predicted the efficacy of anticancer treatments and treatment-related antiapoptotic adaptations in pediatric BCP-ALL PDX models. Finally, we performed this functional assay directly on different pediatric patient samples presenting limited therapeutic options. Following clinicians’ suggestions, we tested several compassionate drug use candidates. Some of the treatments identified by DBP were added to the patients' treatment, achieving complete remission in some cases.

Another limitation of DBP is the number of cells required to perform the assay, especially in solid tumors, where biopsies provide a limited number of viable cells are usually obtained. Microfluidic platforms allow to perform typical laboratory assays by automatizing and miniaturizing the process, thus reducing cell requirement. Therefore,

we developed a microfluidic chip that automatically generates a BIM peptide gradient needed to perform the DBP assay on a small number of treated cancer cells in different microwells. In addition, we also adapted the detection method to be performed in situ in the same chip by fluorescence microscopy. To validate our microfluidic prototype, we used gastrointestinal stromal tumor (GIST) models to compare the results obtained in this microfluidic platform with the standard FACS-based DBP assay, achieving similar results. Finally, we performed these assays with a GIST patient sample, where we could identify a cytotoxic treatment combination, predicted by both the FACS-based DBP and the new microfluidic version, the latter with a 10-fold reduction in the required number cells.

[cat] La medicina personalitzada ha emergit com una alternativa per a millorar el tractament del càncer respecte a altres aproximacions més clàssiques. La identificació de mutacions genètiques mitjançant anàlisis moleculars ha predominat en iniciatives de medicina personalitzada però no ha demostrar un clar benefici clínic. Altres iniciatives fan servir assaigs funcionals, que exposen les cèl·lules canceroses a diferents opcions terapèutiques per identificar quines seran les més efectives en eliminar el tumor. Encara que aquestes tècniques estan menys extenses que les basades en estudis genètics, els primers estudis clínics fent servir assaigs funcionals han obtingut bons resultats. Tot i això, hi han importants limitacions per tal d’aplicar aquestes tècniques, incloent la obtenció de suficient material biològic per a realitzar l'assaig o el deteriorament de la mostra primària en condicions ex vivo. Dynamic BH3 Profiling (DBP) és un assaig funcional que permet la ràpida predicció de la eficàcia dels tractaments, per tant evitant el deteriorament de les mostres. En aquesta tesis, ens hem centrat en trobar nous tractaments efectius per a leucèmia pediàtrica del tipus limfoblàstic agut de precursors de tipus B (BCP-ALL), especialment al petit percentatge de pacients que pateixen casos refractaris o recaigudes després de ser tractats amb el tractament estàndard. Fent servir models in vitro vam poder identificar la eficàcia de diferents quimioterapèutics i teràpies dirigides després de curts tractaments. A més, també vam identificar adaptacions conferint resistència al tractament, fent servir proteïnes antiapoptòtiques de la família BCL-2. Això ens va permetre l’ús de BH3 mimetics, inhibidors específics de proteïnes antiapoptòtiques que han demostrat citotoxicitat en diferents tipus de tumors, especialment afegits en combinació amb altres tractaments contra el càncer. En els nostres models de BCP-ALL vam identificar adaptacions antiapoptòtiques després de ser tractades fent servir el DBP, el que ens va ajudar a dissenyar una nova combinació de quimioteràpia o teràpia dirigida amb un BH3 mimetic per bloquejar la posterior adaptació. Aquestes noves combinacions van millorar l’efecte de tractaments ineficaços o van permetre la reducció de concentració mantenint l’efecte citotòxic. El DBP també va predir la eficàcia de tractaments contra el càncer i les adaptacions que aquests provoquen en models PDX. Finalment, vam realitzar aquest assaig funcional directament en mostres de pacients pediàtrics amb diferents malalties hematològiques sense ninguna opció terapèutica. Seguint els suggeriments dels doctors, vam provar diferents tractaments que es podrien fer servir com a ús compassiu. Gràcies a les nostres prediccions, alguns d’aquests tractaments van ser identificats com efectius per DBP i es va decidir afegir-los al tractament del pacients, aconseguint la remissió completa en alguns d’aquests casos. Una altra limitació del DBP es el número de cèl·lules necessàries per realitzar l’assaig. Especialment en tumors sòlids, una biòpsia és necessària per obtenir una mostra del tumor de la qual normalment s’obtenen un nombre limitat de cèl·lules viables. Les plataformes microfluídiques permeten realitzar assaigs típics del laboratori automatitzant i miniaturitzant el procés. Per tal d’adaptar el DBP a una versió microfluídica, vam desenvolupar un xip que genera automàticament un gradient del pèptid BIM necessari per a realitzar l’assaig i l’exposa a cèl·lules tumorals tractades en diferents pous petits, permetent la reducció del nombre de cèl·lules necessàries per a realitzar el DBP. A més, també vam adaptar el mètode d’identificació per a ser realitzat in situ al mateix xip per microscòpia de fluorescència. Per validar el nostre prototip, vam fer servir dos models de tumor gastrointestinal (GIST) per a comparar els resultats obtinguts en la nostra plataforma microfluídica i l’assaig clàssic, sent capaç la primera d’identificar la eficàcia de tractaments contra el càncer de fora comparable. Finalment, vam repetir el nou assaig amb una mostra d’un pacient de GIST, on vam poder identificar una combinació citotòxica, predita tant per l’assaig clàssic del DBP i la nova versió microfluídica, aquesta última amb una reducció de 10 cops en el número de cèl·lules requerides i amb una automatització del procés.