Synchronous Front-Face fluorescence of milk and whey as an analytical tool for assessing technological functionality of whey

Abstract

El xerigot, que és el principal subproducte de la indústria làctica, conté proteïnes que tenen interès comercial degut al seu valor nutritiu i versàtils propietats funcionals. No obstant, els tractaments tèrmics de la llet i altres processos industrials poden desnaturalitzar les proteïnes i afectar las seves propietats. Aquests canvis produïts en les proteïnes del xerigot no s'avaluen durant la producció industrial. S'ha demostrat que la espectrometria de fluorescència és una tècnica ràpida, sensible i fiable per a avaluar els productes làctics. Por això, l'objectiu d'aquesta tesi ha estat avaluar la espectrometria de fluorescència "front face" com a eina per a estimar la funcionalitat tecnològica del xerigot àcid. Aquest objectiu es va portar a terme a través de la generació de models que permetessin predir la concentració de les proteïnes sèriques natives en llet, la concentració total de proteïna en el xerigot i les seves propietats funcionals mitjançant espectrometria de fluorescència "front face" sincrònica. Per estudiar l'efecte del tractament tèrmic de la llet sobre les proteïnes del xerigot i la resposta de fluorescència sincrònica, es van fer servir llet descremada en pols reconstituïda, dues temperatures (70 i 90°C) i sis temps (0 30min). A part, per avaluar les propietats funcionals del xerigot, tals com la gelificació, formació d'escuma i emulsificació, es van utilitzar llet enriquida (produïda amb llet en pols barrejada amb 5% (p/p) d'aïllat de proteïna de sèrum), una temperatura de 80°C i set temps (0-30min). La fluorescència sincrònica de la llet i del xerigot àcid es va mesurar i correlacionar amb la concentració de proteïnes sèriques i les propietats funcionals tecnològiques. Finalment, es van generar models basats en espectrometria de fluorescència "front face" sincrònica per predir la concentració de proteïnes sèriques natives en llet, concentració total de proteïna del xerigot i les seves propietats funcionals. La gestió de dades sincròniques es va fer utilitzant un codi de programació en llenguatge R creat. Es va desenvolupar amb èxit una metodologia pràctica i ràpida per a la seva anàlisi evitant errors de manipulació i estalviant temps. Es van detectar deu àrees d'interès en els espectres sincrònics i cada àrea va poder ser relacionada amb com a mínim un compost en particular. La recopilació de la informació disponible sobre les respostes fluorescents de la llet i el xerigot ha establert una base sòlida per a futures investigacions i serveix com a referència fonamental. Els espectres sincrònics del xerigot van coincidir totalment amb els de la llet, demostrant que els mateixos fluoròfors són presents en tots dos. Això és avantatjós, ja que fa previsible l'ús de fluoròfors intrínsecs i/o de nova formació com a predictors per estimar, en línia, paràmetres d'interès en el processament de la llet i del xerigot. A més, es va dur a terme una extensa revisió de la literatura per avaluar l'espectrometria de fluorescència "front face" com a mètode alternatiu per determinar i quantificar la desnaturalització tèrmica de les proteïnes. Els tractaments tèrmics aplicats a la llet van provocar variabilitat tant en la resposta de fluorescència com en totes les propietats funcionals estudiades, cosa que va permetre avaluar-les i predir-les mitjançant espectrometria de fluorescència "front face". Es van obtenir excel·lents models de predicció (R2>0.95, RPD>4) per a les propietats de formació de gel i emulsió. No obstant això, per a les propietats escumants, els models obtinguts van ser exitosos (0.90≤R2≤0.95, 3≤RPD≤4) i moderadament útil (0.70≤R2<0.80, 1.75≤RPD<2.25). Aquesta investigació ha demostrat que l'espectrometria de fluorescència té un gran potencial per convertir-se en un mètode en línia per avaluar les proteïnes del xerigot i les seves propietats funcionals, cosa que conduiria a un millor control del procés en la indústria i nous processos i productes.

El suero es el principal sub producto de la industria láctea. Sus proteínas tienen interés comercial por su valor nutritivo y sus versátiles propiedades funcionales. No obstante, los tratamientos térmicos de la leche y otros procesos industriales pueden desnaturalizar las proteínas y afectar a sus propiedades. Estos cambios producidos en las proteínas del suero no se evalúan durante la producción industrial. Se ha demostrado que la espectrometría de fluorescencia es una técnica rápida, sensible y fiable para evaluar los productos lácteos. Por ello, el objetivo de esta tesis ha sido evaluar la espectrometría de fluorescencia "front face" como herramienta para estimar la funcionalidad tecnológica del suero ácido. Dicho objetivo se ha llevado a cabo mediante la generación de modelos que permitan predecir la concentración de proteínas séricas nativas en leche, la concentración total de proteína en el suero y sus propiedades funcionales mediante espectrometría de fluorescencia "front face" sincrónica. Para estudiar el efecto del tratamiento térmico de la leche sobre las proteínas del suero y la respuesta de fluorescencia sincrónica, se usaron leche descremada en polvo reconstituida, dos temperaturas (70 y 90 °C) y seis tiempos (0 30 min). A parte, para evaluar propiedades funcionales del suero tales como la gelificación, formación de espuma y emulsificación, se usó leche enriquecida producida con la misma leche en polvo mezclada con 5% (p/p) de proteína de suero aislada, una temperatura de 80 °C y siete tiempos (0 30 min). Las respuestas en la fluorescencia sincrónica de leche y de suero ácido medidas y relacionadas con la concentración de proteínas séricas y las propiedades funcionales tecnológicas. Finalmente, se generaron modelos basados en espectrometría de fluorescencia "front face" sincrónica para predecir la concentración de proteínas séricas nativas en leche, la concentración total de proteína en el suero y las propiedades funcionales.La gestión de datos sincrónicos se realizó utilizando un código de programación en lenguaje R creado específicamente para su uso en esta tesis. Se desarrolló con éxito una metodología práctica y rápida para su análisis que evita errores de manipulación y ahorra tiempo. Se detectaron diez áreas de interés en los espectros sincrónicos y cada área pudo ser relacionada con al menos un compuesto en particular. La recopilación de la información disponible sobre las respuestas fluorescentes de la leche y el suero ha permitido establecer una base sólida para futuras investigaciones que sirve como referencia fundamental. Los espectros sincrónicos del suero coincidieron totalmente con los de la leche, demostrando que los mismos fluoróforos están presentes en ambos. Esto es ventaja significativa, ya que hace previsible el uso de fluoróforos intrínsecos y/o generados durante el procesado como predictores para estimar, en línea, parámetros de interés en los tratamientos de leche y suero. Además, se llevó a cabo una extensa revisión de la literatura para evaluar la espectrometría de fluorescencia "front face" como método alternativo para determinar y cuantificar la desnaturalización térmica de las proteínas. Los tratamientos térmicos aplicados a la leche provocaron variabilidad tanto en la respuesta de fluorescencia como en todas las propiedades funcionales estudiadas, lo que permitió evaluarlas y predecirlas mediante espectrometría de fluorescencia "front face". Se obtuvieron excelentes modelos de predicción (R2>0.95, RPD>4) para las propiedades de formación de gel y emulsión. Sin embargo, para las propiedades espumantes, los modelos obtenidos fueron exitosos (0.90≤R2≤0.95, 3≤RPD≤4) y moderadamente útil (0.70≤R2<0.80, 1.75≤RPD<2.25). Esta investigación ha demostrado que la espectrometría de fluorescencia "front face" tiene un gran potencial para convertirse en un método in-, on- o at line para evaluar las proteínas del suero y sus propiedades funcionales, lo que conduciría a un mejor control del procesado en la industria, así como a nuevos procesos y productos.

Whey is the major by-product of the dairy industry. Its proteins have a commercial interest due to their nutritional value and versatile functional properties. However, milk heat treatments and other processes could denature whey proteins affecting proteins' attributes. These changes in whey proteins are not assessed during industrial production. Fluorescence spectroscopy has been proven as a rapid, sensitive and reliable technique to evaluate dairy products. Therefore, the current study aimed to evaluate the potential of front-face fluorescence spectroscopy to assess the technological functionality of acid whey by generating prediction models for the total protein content of whey and the undenatured whey protein content of milk as well as several whey functional properties base on synchronous fluorescence response. To study the effect of heat treatment of milk on whey proteins and synchronous front-face fluorescence, reconstituted skim milk powder was treated at two temperatures (70 and 90 °C) and six holding times (0-30 min). In addition, enriched milk produced with the same skim milk powder mixed with 5% (w/w) of whey protein isolate was treated at 80 °C for seven holding times (0-30 min) to evaluate whey functional properties, i.e., gelation, foaming and emulsion stability. Synchronous front-face fluorescence response of milk and acid whey was measured and correlated with whey protein content and technological functional properties. Finally, models based on front-face fluorescence spectroscopy for predicting undenatured whey protein content of milk, total protein content of whey and functional properties were generated. The synchronous data management was performed using a self writing code dedicatedly developed in the present study with R language. A practical and rapid methodology for their analysis was successfully developed avoiding mistakes during data manipulation and saving time. Synchronous spectra were evaluated by areas, where ten areas were displayed, and all of them could be concatenated with at least one particular compound. This work compiled all the information on milk and whey fluorescence responses, establishing a firm foundation for further research and serving as a central reference. The synchronous spectra of whey totally matched those of milk, showing that the same fluorophores are present in milk and whey. This is advantageous, as it makes expectable the potential usage of intrinsic and newly-formed fluorophores as predictors for inline estimation of processing parameters of interest both in milk and whey processing. Furthermore, to better evaluate the potential of front face fluorescence spectroscopy as an alternative method for determining and quantifying the thermal denaturation of whey proteins in milk, first an extensive literature review was carried out. Heat treatments applied on milk provoked variability on fluorescence response as well as on all the studied functional properties, allowing them to be assessed and predicted by front face fluorescence spectroscopy. Excellent prediction models (R2 > 0.95, RPD > 4) were obtained for gel-forming and emulsifying properties. However, for foam properties, the obtained models were successful (0.90 ≤ R2 ≤ 0.95, 3 ≤ RPD ≤ 4) and moderately useful (0.70 ≤ R2 < 0.80, 1.75 ≤ RPD < 2.25). This research has shown that front face fluorescence spectroscopy has a great potential to become an in-, on- or at line method for assessing whey proteins and functional properties based on the changes in fluorescence of intrinsic fluorophores of whey, leading to a better industry process control and new processes and products.