A metabolic engineering approach for alpha-galactosylceramide production in S. cerevisiae

Abstract

Els glicolípids són molècules amb un alt valor afegit degut a les seves propietats amfipàtiques, fet que les involucra en diferents processos cel·lulars importants, així com moltes aplicacions com bio-surfactant o adjuvants en vacunes. Els glicoesfingolípids (GSL) són un grups de glicolípids que es composen per una ceramida (lípid) unida a un glúcid. Entre els GSL, la α-galactosilceramida ha mostrat propietats immunoestimulants, fet que la fa interessant per aplicacions biomèdiques. La producció de α-galactosilceramida és difícil per la complexa síntesis química per obtenir regio- i estèreo-especificitat.

En aquesta tesi presentem una alternativa per a la producció de α-galactosilceramida utilitzant enginyeria metabòlica en el llevat Saccharomyces cerevisiae. L’enginyeria metabòlica es basa en l’ús d’una plataforma biològica que proveeix els precursors (UDP-galactosa i fitoceramida en aquest cas) per a la síntesi de la molècula. A més, una glicosiltransferasa capaç de transferir la galactosa a l’acceptor ceramida hauria de ser present en aquest hoste. Tot i això, aquest enzim no s’havia identificat abans de l’inici d’aquest projecte. Per a la implementació de la nostra proposta són necessàries quatre etapes: (1) re-disseny del metabolisme de l’hoste per a la re-direcció de la producció lipídica cap a fitoceramida, (2) implementar les modificacions en el metabolisme lipídic de l’hoste, (3) identificar una α-galactosilceramida glicosiltransferasa, i (4) expressar aquest enzim identificat en l’hoste modificat considerant els diferents compartiments cel·lulars del llevat.

En la primera etapa, tres gens van ser identificats com a element clau per incrementar el contingut de fitoceramida en el llevat, i per tant, es van proposar 3 modificacions: sobre-expressió de SUR2 i ISC1, i deleció de SCS7.

Segon, la soca de S. cerevisiae RH6082 va ser modificada amb les 3 modificacions. Els gens SUR2 i ISC1 van ser clonats en dos vectors d’expressió en llevat diferents. La seva expressió va ser analitzada per qPCR, tot i així, només SUR2 va demostrar ser sobre-expressat en la soca transformada. A més, la deleció de SCS7 es va fer amb la tecnologia CRISPR/Cas9. Els plasmidis que contenien el gARN de SCS7 per a la re-direcció de Cas9 i el plasmidi amb el ADN donador de SCS7 van ser construïts amb èxit, però la deleció del gen no es va donar després d’analitzar les colònies de llevat transformades.

Tercer, quatre potencials α-GalCer glicosiltransferases van ser identificades de Bacteroides fragilis entre un grup de glicosiltransferases GT4 mitjançant mètodes in silico. L’assaig d’activitat glicosiltransferasa va determinar que només el candidat BF9343_3149 produïa galactosilceramida. Per incrementar la solubilitat de l’enzim, es va expressar fusionat amb la proteïna SUMO, juntament amb un Strep-tag per purificar-la. L’enzim va demostrar ser una glicosiltransferasa no processiva, amb preferència per UDP-Gal abans que UDP-Glc com a substrat donador, i que no mostra dependència de cations metàl·lics. La reacció es dona amb la ceramida solubilitzada amb BSA, però és inhibida quan aquest substrat es presenta en micel·les de DOPG/DOPC.

Finalment, la glicosiltransferasa BF9343_3149 va ser clonada en un vector d’expressió en llevat utilitzant diferents estratègies de re-localització de proteïnes. Tot i això, cap de les soques modificades va presentar activitat glicosiltransferasa, i la microscopia confocal va mostrar que no hi ha co-localització d’enzim i substrat.

Los glicolípidos son moléculas con un alto valor añadido debido a sus propiedades anfipáticas, hecho que los implica en diferentes procesos celulares importantes, así como muchas aplicaciones como bio-surfactantes o adyuvantes en vacunas. Los glicoesfingolípidos (GSL) son un grupo de glicolípidos que se componen por una ceramida (lípido) unida a un glúcido. Entre los GSL, la α-galactosilceramida ha mostrado propiedades inmunoestimulantes, lo que la hace interesante para aplicaciones biomédicas. La producción de α-galactosilceramida es difícil por la compleja síntesis química para obtener regio- y estéreo-especificidad.

En esta tesis presentamos una alternativa para la producción de α-galactosilceramida usando ingeniería metabólica en la levadura Saccharoyces cerevisiae. La ingeniería metabólica se basa en el uso de una plataforma biológica que provee los precursores (UDP-galactosa y fitoceramida en este caso) para la síntesis de la molécula. Además, una glicosiltransferasa capaz de transferir la galactosa al aceptor ceramida debería estar presenta en este huésped. Asimismo, esta enzima no había sido identificada antes del inicio de este proyecto. Para la implementación de nuestra propuesta son necesarias cuatro etapas: (1) rediseño del metabolismo del huésped para la redirección de la producción lipídica hacia la fitoceramida, (2) implementar las modificaciones en el metabolismo lipídico del huésped, (3) identificar una α-galactosilceramida glicosiltransferasa, i (4) expresar esta enzima identificada en el hueste modificado considerando los diferentes compartimentos celulares de la levadura.

En la primera etapa, tres genes fueron identificados como elementos clave para incrementar el contenido de fitoceramida en la levadura, i por tanto, se propusieron 3 modificaciones: sobreexpresión de SUR2 y ISC1, i deleción de SCS7.

Segundo, la cepa de S. cerevisiae RH6082 fue modificada con las 3 modificaciones. Los genes SUR2 y ISC1 se clonaron en dos vectores de expresión en levadura diferentes. Su expresión fue analizada por qPCR, aunque solamente SUR2 demostró ser sobreexpresado en la cepa transformada. Además, la deleción de SCS7 fue implementada mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Los plásmidos que contenían el gran de SCS7 para la redirección de Cas9 y el plásmido con el ADN donador de SCS7 fueron construidos con éxito, sin embargo, la deleción del gen no se observó después de analizar las colonias de levadura transformadas.

Tercero, cuatro potenciales α-GalCer glicosiltransferasas fueron identificadas de Bateroides fragilis entre un grupo de glicosiltranferasas GT4 mediante métodos in silico. El ensayo de actividad glicosiltransferasa determinó que solamente el candidato BF9343_3149 producía galactosilceramida. Para incrementar la solubilidad de la enzima, se expresó fusionándola con la proteína SUMO, junto con un Strep-tag para purificarla. La enzima demostró ser una glicosiltransferasa no procesiva, con preferencia para UDP-Gal antes que UDP-Glc como sustrato donador, y que no muestra dependencia de cationes metálicos. La reacción se da con la ceramida solubilizada con BSA, pero es inhibida cuando este sustrato se presenta en micelas de DOPG/DOPC.

Finalmente, la glicosiltransferasa BF9343_3149 se clonó en un vector de expresión en levadura usando diferentes estrategias de relocalización de proteínas. Aun así, ninguna de las cepas modificadas presentó actividad glicosiltransferasa, y la microscopia confocal mostró que no hay co-localización de enzima y sustrato.

Glycolipids are molecules of high-added value due to their amphipathic properties, which involve them in several important cellular processes, as well as in many applications such as biosurfactants or vaccine adjuvants. Glycosphingolipids (GSL) is one of the glycolipids families which are composed of a ceramide lipid bound to a sugar moiety. Among GSL, α-galactosylceramide (α-GalCer) has shown immunostimulatory properties which is interesting for biomedical applications. Production of α-GalCer is difficult for the complex chemical synthesis to obtain the specific regio- and stereospecificity.

In this thesis we report an alternative approach using metabolic engineering to produce α-galactosylceramide in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Metabolic engineering is based on the use of a biological platform that provides the precursors -UDP-galactose and phytoceramide in this case- for the synthesis of the molecule. In addition, a glycosyltransferase capable of transferring galactose to the ceramide acceptor should be present in the host. However, no such enzyme was identified previously to the start of this project. For the implementation of our approach, four steps were necessary: (1) redesign of the host metabolism to forward lipid production to phytoceramide pool, (2) perform modifications on the host lipid metabolism, (3) identification of an α-GalCer glycosyltransferase, and (4) expression of the identified enzyme in the engineered host considering the different yeast compartments.

In the first step, three genes were identified to be key elements to increase phytoceramide pool in yeast, and three gene modifications were planned: SUR2 and ISC1 overexpression, and SCS7 deletion.

Secondly, S. cerevisiae RH6082 strain was engineered with these modifications. SUR2 and ISC1 genes were cloned into two different yeast expression vectors. Expression was analyzed by qPCR, however, only SUR2 proved to be overexpressed in the transformed strain. In addition, CRISPR/Cas9 technology was used for SCS7 gene knockout. The plasmids containing SCS7 gRNA for Cas9 targeting and SCS7 donor DNA plasmid were successfully constructed, however, no SCS7 knockout resulted after yeast transformation.

Thirdly, four potential α-GalCer glycosyltransferases were identified from Bacteroides fragilis among a pool of GT4 glycosyltransferases using in silico methods. Galactosyltransferase activity assay determined that only BF9343_3149 candidate formed galactosylceramide. To improve solubility, the enzyme was expressed as a SUMO fusion protein, with Strep tag for purification. The enzyme proved to be a non-processive glycosyltransferase that prefers UDP-Gal over UDP-Glc as donor substrate and showed no metal dependance. The reaction occurs when ceramide is solubilized with BSA but it is inhibited when ceramide is presented in DOPG/DOPC micelles.

Finally, glycosyltransferase BF9343_3149 was cloned into a yeast expression vector using different relocation strategies. However, engineered yeast strains did not show any GalCer glycosyltransferase activity, and confocal microscopy showed no co-location of enzyme and substrate.