Control of listeria monocytogenes biofilms in the food industry: fighting a recurring problem by studying its formation and elimination

Abstract

Aquest treball es va emmarcar al Projecte Nacional LISSA (RTI2018-098267-R-C32), projecte que centra els seus objectius en dues estratègies innovadores en el camp de les aplicacions alternatives antibiofilm. En aquesta tesi es van dur a terme diferents estudis, enfocats a comprendre la influència dels tractaments per al control de biofilms de L. monocytogenes. En primer lloc, partint d’un model in vitro estàndard per a biofilms de L. monocytogenes, es va avaluar l’eficàcia d’un producte enzimàtic per al despreniment de biofilms. Els resultats van mostrar que l’efectivitat contra biofilms madurs estava compresa entre el 85 i el 99% per les diferents soques estudiades. Els resultats van mostrar que el despreniment d’aquestes estructures pot estar relacionat amb el cep en estudi. En un segon estudi es van comparar onze tractaments, entre agents enzimàtics aplicats a diferents temperatures i concentracions, detergents alcalins i àcids, per a l’eliminació de L. monocytogenes S2-bac. Els resultats van mostrar que les cèl·lules de L. monocytogenes, que componen els biofilms, van disminuir sobre els recomptes després d’aplicar els tractaments àcid, alcalí i alcalí clorat en 6.03, 6.24 i 4.76 Log UFC/cm2, respectivament. L’observació de l’estructura dels biofilms a la superfície, mitjançant microscòpia d’epifluorescència directa (DEM), va mostrar que els tractaments convencionals no aconseguien eliminar les estructures. Els tractaments enzimàtics aplicats a 50ºC van obtenir el despreniment més gran i l’activitat biocida, encara que sense arribar a la mostrada pel tractament combinat, que va millorar l’eficàcia. En tercer lloc, atès que la principal preocupació respecte a la consolidació de biofilms a la indústria alimentària és la contaminació creuada del producte, es va considerar necessari avaluar l’impacte en termes de transferència. Es va fer una comparació sobre l’efectivitat del tractament alcalí clorat versus el tractament combinat avaluat a l’etapa anterior d’aquesta tesi. També es va avaluar la contaminació creuada amb brou de pollastre, centrant-se en biofilms no tractades i tractades. Els resultats van mostrar que, quan els biofilms no van ser sotmesos a tractament, les taxes de transferència obtingudes van donar lloc a contaminació creuada (20,4%), cosa que representa un risc potencial per a la seguretat alimentària, ja que aproximadament 1,66x104 cèl·lules estarien migrant al producte. El tractament convencional va transferir taxes similars a les obtingudes pels biofilms sense tractar, al contrari del que s’ha obtingut després de l’aplicació del tractament combinat, que va demostrar no produir contaminació creuada. Posteriorment es va avaluar l’impacte del tractament, tant convencional com a combinat. Alhora, es va estudiar la capacitat de regeneració de les cel·les que componen l’estructura, després de l’aplicació dels tractaments seleccionats, per veure si la càrrega residual romanent podia reconstruir l’estructura passades 24 hores. El tractament alternatiu va ser significativament (P < 0,05) més efectiu que el convencional, però cap va erradicar completament el patogen de les superfícies provades. Es va trobar regeneració de biofilm, aconseguint-se recomptes cel·lulars similars als controls. Finalment, es va fer un estudi per determinar la contaminació microbiana a diferents superfícies industrials d’una indústria càrnica. Posteriorment, es va aplicar un tractament antibiofilm durant diverses setmanes per determinar l’impacte de reducció dels diferents grups microbians. Els resultats obtinguts van mostrar dos grups principals d’àrees amb major i menor grau de contaminació microbiològica, i els recomptes d’aerobis totals van ser el grup microbià amb més contribució. Es va detectar la presència de L. monocytogenes en cinc superfícies diferents al llarg del mostreig. El tractament antibiofilm aplicat va mostrar una reducció a tots els grups microbians.

Este trabajo se enmarcó en el Proyecto Nacional LISSA (RTI2018-098267-R-C32), proyecto que centra sus objetivos en dos estrategias innovadoras en el campo de las aplicaciones alternativas de antibiofilm. En esta tesis se llevaron a cabo diferentes estudios, enfocados a comprender la influencia de los tratamientos para el control de biofilms de L. monocytogenes. En primer lugar, partiendo de un modelo in vitro estándar para biofilms de L. monocytogenes, se evaluó la eficacia de un producto enzimático para el desprendimiento de biofilms. Los resultados mostraron que la efectividad contra biofilms maduros estaba comprendida entre 85 y 99% para las diferentes cepas estudiadas. Los resultados mostraron que el desprendimiento de estas estructuras puede estar relacionado con la cepa en estudio. En un segundo estudio se compararon once tratamientos, entre agentes enzimáticos aplicados a diferentes temperaturas y concentraciones, detergentes alcalinos y ácidos, para la eliminación de L. monocytogenes S2-bac. Los resultados mostraron que las células de L. monocytogenes, que componen los biofilms, disminuyeron sus recuentos después de aplicar los tratamientos ácido, alcalino y alcalino clorado en 6.03, 6.24 y 4.76 Log UFC/cm2, respectivamente. La observación de la estructura de los biofilms en la superficie mediante microscopía de epifluorescencia directa (DEM) mostró que los tratamientos convencionales no conseguían eliminar las estructuras. Los tratamientos enzimáticos aplicados a 50ºC obtuvieron el mayor desprendimiento y actividad biocida, aunque sin llegar a la mostrada por el tratamiento combinado, que mejoró la eficacia. En tercer lugar, dado que la principal preocupación con respecto a la consolidación de biofilms en la industria alimentaria es la contaminación cruzada del producto, se consideró necesario evaluar el impacto en términos de transferencia. Se realizó una comparación sobre la efectividad del tratamiento alcalino clorado versus el tratamiento combinado evaluado en la etapa anterior de esta tesis. También se evaluó la contaminación cruzada con caldo de pollo, centrándose en biofilms no tratados y tratados. Los resultados mostraron que, cuando los biofilms no fueron sometidos a tratamiento, las tasas de transferencia obtenidas dieron lugar a contaminación cruzada (20,4%), lo que representa un riesgo potencial para la seguridad alimentaria, ya que aproximadamente 1,66x104 células estarían migrando al producto. El tratamiento convencional transfirió tasas similares a las obtenidas para los biofilms sin tratar, al contrario de lo obtenido tras la aplicación del tratamiento combinado, que demostró no producir contaminación cruzada. Posteriormente se evaluó el impacto del tratamiento, tanto convencional como combinado. Al mismo tiempo, se estudió la capacidad de regeneración de las celdas que componen la estructura, tras la aplicación de los tratamientos seleccionados, para ver si la carga residual remanente podía reconstruir la estructura pasadas 24 horas. El tratamiento alternativo fue significativamente (P < 0,05) más efectivo que el convencional, pero ninguno de ellos erradicó por completo el patógeno de las superficies probadas. Se encontró regeneración de biofilm, lográndose recuentos celulares similares a los controles. Finalmente, se realizó un estudio para determinar la contaminación microbiana en diferentes superficies industriales de una industria cárnica. Posteriormente, se aplicó un tratamiento antibiofilm durante varias semanas, para determinar el impacto de reducción de los diferentes grupos microbianos. Los resultados obtenidos mostraron dos grupos principales de áreas con mayor y menor grado de contaminación microbiológica, siendo los recuentos de aerobios totales el grupo microbiano con mayor contribución. Se detectó la presencia de L. monocytogenes en cinco superficies diferentes a lo largo del muestreo. El tratamiento antibiofilm aplicado mostró una reducción en todos los grupos microbianos.

The present work is included in the LISSA National Project (RTI2018-098267-R-C32), a project that focuses its objectives on two innovative strategies in the field of alternative antibiofilm applications. Different studies were carried out on this thesis, focused on understanding the influence of treatments for L. monocytogenes biofilms control. In the first place, starting from a standard in vitro model for L. monocytogenes biofilms, it was proceeded to evaluate the efficacy of an enzymatic product for the detachment of biofilms. The results showed that detachment effectiveness of mature biofilms was comprised between 85 and 99 % for the different L. monocytogenes strains. The results showed that the detachment of these structures may be directly related to the strain under study, and may be due to the fact that some strains are capable of generating biofilms with a more robust matrix. In a second study, eleven treatments were compared, including enzymatic agents applied at different temperatures and concentrations, alkaline and acid detergents, for the elimination of L. monocytogenes S2-bac. Results showed that L. monocytogenes cells conforming the biofilms diminished their counts after applying the acid, alkaline and chlorinated alkaline treatments on 6.03, 6.24 and 4.76 Log CFU/cm2, respectively. The observation of the biofilms remaining structure on the surface by direct epifluorescence microscopy (DEM) demonstrated that conventional treatments were not able to eliminate the formed structures. The enzymatic treatments applied at 50ºC obtained the highest detachment and biocidal activity, although without reaching what was shown by the combined treatment, which improved cell dispersion and increased the effectiveness. Thirdly, given that the main concern regarding biofilms consolidation in the food industry is cross-contamination to the product, it was considered necessary to evaluate the impact in terms of transference. A comparison was made on the effectiveness of chlorinated alkaline versus the combined treatment evaluated in the previous stage of this thesis, for the elimination of biofilms formed by different L. monocytogenes strains. Cross-contamination to chicken broth was evaluated too, targeting untreated and treated biofilms. The results showed that, when the biofilms were not subjected to treatment, the transference rates obtained led to cross-contamination (20.4 %), which represents a potential risk for food safety, since approximately 1.66x104 cells would be migrating to the product. The conventional treatment transferred rates similarly to those obtained for the untreated biofilms, contrary to what was obtained after the application of the combined treatment, which proved not to produce cross-contamination to the chicken broth due to its high detachment effectiveness. Afterwards, the impact of both the conventional and the combined treatment was evaluated. At the same time, the regeneration capacity of cells conforming the structure was studied after the application of the selected treatments to observe if the remaining residual load could consolidate the structure again after 24 hours. The alternative treatment was significantly (P < 0.05) more effective than the conventional one, but none of them completely eradicated the pathogen from the tested surfaces. Biofilm regeneration was found, achieving cell counts like controls. Finally, a study was carried out to determine the microbial contamination in different industrial surfaces of a meat industry. Subsequently, an antibiofilm treatment was applied for several weeks to determine the reduction impact of the different microbial groups, focusing on L. monocytogenes detection. The results obtained showed two main groups of zones with greater and lesser degree of microbiological contamination, being the total aerobic counts the microbial group with the highest contribution. L. monocytogenes presence was detected on five different surfaces throughout the sampling. The applied antibiofilm treatment showed a reduction in all the microbial groups.