Enfermedad de Chagas crónica: estrategias de mejora del diagnóstico molecular y alternativas al cribado serológico convencional

Abstract

La fase crònica de la malaltia de Chagas (MC) es caracteritza per una baixa parasitèmia i cursa de forma asimptomàtica en la majoria dels casos. Les tècniques moleculars basades en l’amplificació d’àcids nucleics tenen un valor limitat per ser utilitzades com a eines diagnòstiques en aquesta fase. Un dels protocols més àmpliament utilitzats per a la detecció d’ADN de Trypanosoma cruzi consta d’un mètode d’extracció d’ADN basat en columnes de sílice i una PCR a temps real per a l’amplificació d’ADN satèl•lit, dissenyada fa més de deu anys. D’altra banda, l’absència de símptomes en aquesta fase, les barreres d’accés al sistema sanitari, així com la por i l’estigma fa que el diagnòstic precoç de la MC sigui difícil i estigui altament infradiagnosticada. En aquest context, les intervencions a la comunitat poden afavorir l’accés a la població susceptible augmentant la cobertura del diagnòstic. Així, aquesta Tesi Doctoral té com a objectiu principal avaluar alternatives en la metodologia existent per a la detecció molecular i el cribratge serològic de la infecció crònica per T. cruzi. Segons els resultats obtinguts, la implementació de sistemes d’extracció d’ADN automatitzats, així com la realització de tres rèpliques d’extracció i l’ús d’un nou conjunt d’encebadors milloren la detecció d’ADN de T. cruzi per PCR a temps real. A més, una estratègia de cribratge serològic basada en la realització d’una prova ràpida i, en els casos de resultat negatiu, serologia convencional mitjançant mostra de sang en paper sec, va assolir una sensibilitat del 97%. Es va implementar una estratègia de cribratge serològic oportunista per a persones provinents d’àrea endèmica a través d’un programa realitzat en les farmàcies comunitàries de la ciutat de Barcelona.

La fase crónica de la enfermedad de Chagas (EC) se caracteriza por una baja parasitemia y cursa de forma asintomática en la mayoría de los casos. Las técnicas moleculares basadas en la amplificación de ácidos nucleicos tienen un valor limitado para ser usadas como herramientas diagnósticas en esta fase. Uno de los protocolos más ampliamente utilizado para la detección de ADN de Trypanosoma cruzi consta de un método de extracción de ADN basado en columnas de sílice y una PCR a tiempo real para la amplificación de ADN satélite, diseñada hace más de diez años. Por otro lado, la ausencia de síntomas en esta fase, las barreras de acceso al sistema sanitario, así como el miedo y el estigma, hace que el diagnóstico temprano de la EC sea difícil y esté altamente infradiagnosticada. En este contexto, las intervenciones en la comunidad pueden favorecer el acceso a la población susceptible aumentando la cobertura del diagnóstico. Así, esta Tesis Doctoral tiene como objetivo principal evaluar alternativas en la metodología existente para la detección molecular y el cribado serológico de la infección crónica por T. cruzi. Según los resultados obtenidos, la implementación de sistemas de extracción de ADN automatizados, así como la realización de tres réplicas de extracción y el uso de un nuevo conjunto de cebadores mejoran la detección de ADN de T. cruzi por PCR a tiempo real. Además, una estrategia de cribado serológico basada en la realización de una prueba rápida y, en los casos de resultado negativo, serología convencional mediante muestra de sangre en papel seco, alcanzó una sensibilidad del 97%. Se implementó una estrategia de cribado serológico oportunista para personas provenientes de área endémica a través de un programa realizado en las farmacias comunitarias de la ciudad de Barcelona.

The chronic phase of Chagas disease (CD) is characterized by low parasitemia and is asymptomatic in a majority of cases. Nucleic acid amplifications tests are of limited value for use as a diagnostic tool in this phase. One of the most widely used protocols for molecular detection of T. cruzi consists of a DNA extraction method based on silica columns and a real-time PCR for satellite DNA amplification, designed more than ten years ago. On the other hand, the absence of symptoms at this stage, in addition to barriers to access to the healthcare system, as well as fear and stigma, makes early diagnosis of CD difficult and highly underdiagnosed. In this context, community interventions can reach the susceptible population, increasing the diagnostic coverage. Thus, the main objective of this Doctoral dissertation is to evaluate alternatives in the existing methodology for molecular and serological screening of chronic T. cruzi infection. According to the results obtained, the implementation of automated DNA extraction systems, as well as the performance of three extraction replicates and the use of a new set of primers improve the detection of T. cruzi DNA by real-time PCR. Moreover, a screening strategy based on performing a rapid test and, in cases of a negative result, serology using a blood sample on dry paper reached a sensitivity of 97%. An opportunistic serological screening strategy of people from endemic area was implemented through a program carried out in community pharmacies in the city of Barcelona.