Molecular mechanisms of resistance to therapy in glioblastoma

Abstract

[cat] El glioblastoma (GBM) és el tumor primari cerebral més freqüent i més agressiu. Els pacients amb GBM tenen una supervivència mitjana de 15 mesos. Una dels principals dificultats que presenten els GBMs per ser tractats és la seva elevada heterogeneïtat inter-tumoral (entre pacients) i intra-tumoral (dins d’un mateix tumor). El GBMs es poden classificar en quatre subtipus segons el seu perfil epigenètic i expressió gènica: G-CIMP+ i tres G-CIMP- anomenats proneurals (PN), clàssics (CL) i mesenquimal (MES). S’ha observat que aquests subtipus moleculars no són estàtics i poden presentar transicions d’un subtipus a un altre. A més, dins d’un mateix tumor hi podem trobar diferents tipus cel·lulars, com les cèl·lules mare iniciadores de gliomes (GICs) que tenen capacitat d’auto-renovar-se i generar el tumor de nou. A més, les GICs també es poden classificar en els subtipus moleculars i poden fer transicions d’un subtipus a un altre.

Aquesta tesis doctoral consta de dos projectes que es centren en identificar possibles mecanismes moleculars que confereixen resistència a les teràpies actuals als GBMs. En el primer projecte hem identificat dos long non-coding RNAs (lncRNAs) que podrien regular la capacitat d’auto-renovació de les GICs, la qual permet generar el tumor de nou, fent recidivar el GBM. En el segon projecte hem corroborat la funció de GPR56 en la diferenciació de les GICs al subtipus MES, procés correlacionat amb la resistència a les teràpies en GBMs.

Pel projecte dels lncRNAs, vam fer RNA-seq de mostres de teixit tumoral de GBM. Les mostres es van classificar segons el subtipus de GBM i es va realitzar un network anàlisis ponderat de co-expressió gènica (WGCNA) per tal de seleccionar els lncRNAs candidats. Els tres lncRNAs candidats van ser PAUPAR, PROCAR i LINC00941, els quals es co-expressaven amb algun dels gens principals dels subtipus de GBM i tenien un elevat valor de predicció d’importància dins del network. Per estudiar-los uncionalment, vam generar GICs amb knockdowns dels lncRNAs candicats, mitjançant short hairpin RNAs (shRNAs). Amb aquest mètode, vam aconseguir noquejar l’expressió PAUPAR en GICs clàssiques i el LINC00941 en les GICs mesenquimals. Finalment, vam estudiar si la capacitat d’auto-renovació de les GICs estava afectada per la pèrdua d’expressió dels lncRNA i si hi havia alguna transició entre els diferents subtipus de GBM. Les shlncRNA-GICs formen menys neurosferes que les control, indicant que les GICs amb menys expressió d’aquests lncRNAS tenen disminuïda la capacitat d’auto-renovació. A l’estudiar l’expressió de varis gens dels subtipus de GBM amb RT-qPCR i citometria de flux, no es van observar transicions entre els subtipus. Per tant, PAUPAR i LINC00941 podrien estar mantenint la capacitat d’auto-renovació de les GICs afavorint la recurrència dels pacients després dels tractaments sense intervenir en les transicions dels subtipus de GBM.

Per altra banda, per estudiar la funció de la proteïna de membrana GPR56 en les GICs, vam generar GICs proneurals amb knockout per GPR56, mitjançant CRISPR, i GICs clàssiques amb knockdown de GPR56, mitjançant shRNAs. Un cop generades les línies amb menys expressió de GPR56, vam estudiar diferents marcadors MES per citometria de flux i per RT-qPCR, observant un augment dels marcadors MES en les KO-GPR56-PN-GICs i en les shGPR56-CL-GICs. Aquests resultats suggereixen que GPR56 està inhibint la diferenciació de les GICs PN i CL al subtipus MES. Per tant, GPR56 podria ser important en la inhibició del guany de resistència a la teràpia.

Per tant, podem dir que hem identificat dos molècules que podrien estar involucrades en mecanismes de resistència a les teràpies. PAUPAR i LINC00941 podrien estar involucrats en la recurrència dels pacients mantenint la capacitat d’auto-renovació de les GICs i GPR56 inhibint la diferenciació cap al subgrup MES, la qual augmenta la resistència a les teràpies en GBM.