Aspectos clave para el desarrollo de inmunosensores digitales electroquímicos sostenibles

Abstract

Els test en el lloc d’assistència del pacient (més conegut pel seu nom en anglès, Point-of-Care) (POC) son necessaris per que permeten realitzar un primer diagnòstic ràpid fora d’un laboratori especialitzat. Per un costat, dins dels POC, podem trobar dispositius relativament sofisticats capaços de quantificar i emmagatzemar la informació proporcionada per un o varis sensors, amb la desavantatge que en la majoria de casos el seu cost per unitat es molt elevat. D’altra banda, trobem dispositius basats en paper extremadament senzills i d’un cost molt baix, com els denominats test de flux lateral, en el que es realitza un immunoassaig amb una sola gota de saliva, sang, suor o orina. Alguns d’aquests exemples d’aquests últims son els test d’embaràs, el test d’VIH o el més recent test ràpid per a la detecció del SARS-CoV-2. Els test de flux lateral tenen una resposta qualitativa o semi-quantitativa que permet una inspecció visual del resultat, mentre que, si es requereix d’una quantificació més precisa i inequívoca, es necessita de la incorporació d’un sistema de lectura. En aquest sentit, s’han estudiat diferents tècniques per quantificar la senyal, sent la més prometedora l’ús de tècniques electroquímiques. No obstant, totes les propostes realitzades fins la data segueixen sent fonts d’alimentació externes i mòduls electrònics, incomplint així bona part dels criteris ASSURED proposats per la OMS. Així, urgeix la necessitat de trobar una alternativa viable capaç d’aportar una lectura a un cost mínim i sense requerir d’equips externs. En aquest sentit, aquesta tesi profunditza en diversos aspectes encaminats a estudiar la viabilitat d’un test electroquímic autoalimentat d’un sol ús que pugui complir amb els criteris de cost, simplicitat i sostenibilitat requerits per a convertir-se en un test d’impacte global. El primer capítol experimental de la tesi descriu quins efectes pot tenir la selecció de diferents papers comunament emprats en els dispositius analítics basats en paper en la resposta electroquímica d’un sensor. Aquest estudi resulta nou, ja que, malgrat que hi ha un gran número de dispositius de paper publicats, no existeix cap estudi detallat sobre l’efecte de la porositat del paper en la resposta electroquímica d’aquests. Els resultats obtinguts experimentalment van ser validats mitjançant simulacions realitzades en COMSOL Multyphisics®. Gràcies a això, s’ha pogut demostrar que l’elecció del paper juga un paper determinant en la sensibilitat del sistema. En el segon capítol experimental es presenta un prototip d’un dispositiu basat en paper en el que es realitza un immunoassaig completament auto-alimentat per la detecció del biomarcador CRP. La detecció del biomarcador es realitza mitjançant anticossos marcats amb l’enzim HRP. A l’immunoassaig es fa servir Mg com ànode i benzoquinona (BQ) produïda per l’enzim com catolit, de tal forma que l’energia produïda es directament proporcional a la concentració del marcador a detectar. Els valors de detecció obtinguts amb aquest sistema es troben dins d’un rang clínic rellevant – entre 1 i 3 mg·L-1 de CRP – i amb voltatges de sortida majors a 1.55V. Aquest capítol presenta un punt de partida cap a una nova generació d’immunoassaigs digitals i auto-alimentats molt més senzills i assequibles que els actualment presents en el mercat del diagnòstic. Finalment, amb el fi de substituir els enzims per compostos inorgànics amb major reproductibilitat i robustesa que permetin disminuir variabilitats en els dispositius de diagnòstic, així com simplificar el disseny i abaratir els costs, en el tercer capítol experimental es va procedir a estudiar la viabilitat de fer servir nanopartícules (NP) de ceria com a agents catalítics. Els resultats ens mostren que, a diferència del que és àmpliament reportat, les NPs de ceria no actuen com catalitzadors de la reacció d’oxidació d’un mediador, si no que es comporten com agents oxidants. Aquesta característica fa que la quantitat de molècules de ferrocianur oxidades per cada NP present a la mostra sigui fixa i que, a més, la reacció d’oxidació s’aturi un cop consumit tot el ceri disponible. La caracterització d’aquests materials han demostrat una alta reproductibilitat inclús en condicions d’emmagatzematge poc controlats, fet que el fa firmes candidates a substituir als enzims que es fan servir en els immunoassaigs actuals.

Los test en el lugar de asistencia del paciente (más conocido por su nombre en inglés, Point-of-Care) (POC) son necesarios porque permiten realizar un primer diagnóstico rápido fuera de un laboratorio especializado. Por un lado, dentro de los POC, podemos encontrar dispositivos relativamente sofisticados capaces de cuantificar y almacenar la información proporcionada por uno o varios sensores, con la desventaja de que en la mayoría de los casos su coste es por unidad es muy elevado. Por el otro lado, encontramos dispositivos basados en papel extremadamente sencillos y de muy bajo coste, como los denominados test de flujo lateral, en los que se realiza un inmunoensayo con solo una gota de saliva, sangre, sudor u orina. Algunos ejemplos de estos últimos son el test de embarazo, el test del VIH o el más reciente test rápido para la detección del SARS-CoV-2. Los test de flujo lateral tienen una respuesta cualitativa o semicuantitativa que permite una inspección visual del resultado, mientras que, si se requiere de una cuantificación más precisa e inequívoca, se necesita incorporar un sistema de lectura. En este sentido, se han estudiado diferentes técnicas para cuantificar la señal, siendo la más prometedora el uso de técnicas electroquímicas. Sin embargo, todas las propuestas realizadas hasta la fecha siguen usando fuentes de alimentación externas y módulos electrónicos, incumpliendo así buena parte de los criterios ASSURED propuestos por la OMS. Así, urge la necesidad de encontrar una alternativa viable capaz de aportar una lectura a un coste mínimo y sin requerir de equipos externos. En este sentido, esta tesis profundiza en diversos aspectos encaminados a estudiar la viabilidad de un test electroquímico autoalimentado de un solo uso que pueda cumplir con los criterios de coste, simplicidad y sensibilidad requeridos para convertirse en un test de impacto global. El primer capítulo experimental de la tesis describe qué efectos puede tener la selección de distintos papeles comúnmente empleados en los dispositivos analíticos basados en papel en la respuesta electroquímica de un sensor. Este estudio resulta novedoso, ya que, a pesar del gran número de dispositivos de papel publicados hasta la fecha, no existía ningún estudio detallado sobre el efecto de la porosidad del papel en la respuesta electroquímica de los mismos. Los resultados obtenidos experimentalmente fueron validados mediante simulaciones realizadas en COMSOL Multyphisics®. Gracias a ello se ha podido demostrar que la elección del papel juega un papel determinante en la sensibilidad del sistema. En el segundo capítulo experimental se presenta un prototipo de un dispositivo basado en papel en el que se realiza un inmunoensayo completamente autoalimentado para la detección del biomarcador CRP. La detección del biomarcador se realiza mediante anticuerpos marcados con la enzima HRP. En el inmunoensayo se usa Mg como ánodo y la benzoquinona (BQ) producida por la enzima como catolito, de tal forma que la energía producida es directamente proporcional a la concentración del marcador a detectar. Los valores de detección obtenidos con este sistema se encuentran dentro de un rango clínico relevante - entre 1 y 3 mg·L-1 de CRP - y con voltajes de salida mayores a 1.55 V. Este capítulo presenta un punto de partida hacia una nueva generación de inmunoensayos digitales y autoalimentados mucho más sencillos y asequibles que los actualmente presentes en el mercado del diagnóstico. Finalmente, con el fin de substituir las enzimas por compuestos inorgánicos con mayor reproducibilidad y robustez que permitan disminuir variabilidades en los dispositivos de diagnóstico, así como simplificar el diseño y abaratar los costes, en el tercer capítulo experimental se procedió a estudiar la viabilidad de usar nanopartículas (NP) de ceria como agentes catalíticos. Los resultados nos muestran que, a diferencia de lo ampliamente reportado, las NPs de ceria no actúan como catalizador de la reacción de oxidación de un mediador, sino que se comportan como agente oxidante. Esta característica hace que la cantidad de moléculas de ferrocianuro oxidadas por cada nanopartícula presente en la muestra sea fija y que, además, la reacción de oxidación se detenga una vez consumido todo el cerio disponible. La caracterización de estos materiales ha demostrado una alta reproducibilidad incluso en condiciones de almacenamiento poco controladas, lo que las hace firmes candidatas a substituir a las enzimas usadas en los inmunoensayos actuales.

Point-of-care (POC) tests are necessary because they allow a rapid diagnosis to be made outside of a specialized laboratory. Within the POC, we can find relatively sophisticated devices capable of quantifying and storing the information provided by one or several sensors, with the disadvantage that in most cases their cost per unit is very high. Within POC, paper-based devices are extremely simple and low-cost, such as the so-called lateral flow tests, in which an immunoassay is performed with just a drop of saliva, blood, sweat, or urine. Some examples are the pregnancy test, the HIV test or test for the detection of SARS-CoV-2. The lateral-flow tests have a qualitative or semi-quantitative response that allows a visual inspection of the result, however, when a more precise and unequivocal quantification is required, it is necessary to incorporate a reading system. Different techniques have been studied to quantify the signal, the most promising being the use of electrochemical techniques. However, up to date all the proposals have been carried out from external power sources and electronic modules, breaching part of the ASSURED criteria proposed by the WHO. Therefore, there is an urgent need to find a viable alternative capable of providing a reading at a minimum cost and without requiring external equipment. Consequently, this thesis delves into various aspects aimed at studying the feasibility of a single-use self-powered electrochemical test that can meet the criteria of cost, simplicity and sensitivity required to become a global impact test. The first experimental chapter describes which effects may have the selection of different papers commonly used in paper-based analytical devices on the electrochemical response. This study is innovative as there was no detailed study on the effect of paper porosity on the electrochemical response despite the larger number of studies published to date. The results obtained experimentally were validated by means of simulations carried out in COMSOL Multyphisics®. Thanks to this, it has been possible to demonstrate that the choice of paper plays a determining role in the sensitivity of the system. The second experimental chapter, a prototype of a paper-based device is presented in which a completely self-powered immunoassay is performed for the detection of the CRP biomarker. The detection is carried out by means of antibodies marked with the HRP enzyme. Then, Mg is used as anode while benzoquinone (BQ) produced by the enzyme is used as catholyte, therefore, the energy produced is directly proportional to the concentration of the biomarker. The detection values obtained with this system are within a relevant clinical range and with output voltages greater than 1.55 V. This chapter presents a starting point towards a new generation of digital and self-powered immunoassays much simpler and more affordable than those currently present in the diagnostic market. Finally, in order to replace enzymes with inorganic compounds with greater reproducibility and robustness that allow to reduce variabilities in diagnostic devices, as well as simplify the design and lower costs, in the third experimental chapter we proceeded to study the feasibility of using ceria nanoparticles (NP) as catalytic agents. The results show us that, contrary to what has been widely reported, ceria NPs do not act as a catalyst for the oxidation reaction of a mediator, but rather behave as an oxidizing agent. This characteristic means that the number of ferrocyanide molecules oxidized per NP present in the sample is fixed and the oxidation reaction stops once all the available cerium is consumed. The characterization of these materials has shown high reproducibility even under poorly controlled storage conditions, which makes them strong candidates to replace the enzymes used in current immunoassays.