Métodos avanzados de microscopía de fuerzas electrostáticas para el estudio de muestras biológicas

Abstract

[spa] Las propiedades dieléctricas de las células han sido objeto de una intensa investigación a lo largo de los años debido a su relevancia en muchos problemas biológicos fundamentales. Destacamos la importancia de la caracterización dieléctrica de las células en diferentes campos, incluyendo la medicina y la biotecnología. Para su estudio se han desarrollado diferentes técnicas. Las mediciones basadas en la impedancia proporcionan una descripción limitada de las propiedades dieléctricas de las células a nivel local, lo que resulta en valores promediados de las variaciones espaciales a lo largo de la propia célula. Para obtener una resolución espacial submicrométrica cuantitativa se han desarrollado nuevas técnicas, basadas en la microscopía de sonda de barrido (Scanning Probe Microscopy, SPM), que ofrecen una ruta alternativa para mapear las propiedades dieléctricas de las células. Las técnicas SPM basadas en la medición de la fuerza eléctrica, como la microscopía de barrido dieléctrico (Scanning Dielectric Microscopy, SDM) en modo de detección de fuerza, ofrecen una ruta alternativa para mapear las propiedades dieléctricas de las células. Sin embargo, la extensión de este enfoque a las células en condiciones líquidas no es inmediata, ya que el SDM en líquidos desencadena una compleja respuesta dependiente de la frecuencia y el voltaje en el sistema, en la que intervienen fenómenos como la difusión iónica, la tensión superficial o las reacciones químicas. Para reducir estos problemas, se han desarrollado nuevos métodos. La presente tesis tiene por objetivo desarrollar métodos avanzados, tanto en aire como en medio líquido, que permitan superar las capacidades de los métodos existentes en la actualidad para el estudio de las propiedades eléctricas a la nanoescala, especialmente en su aplicación a medio líquido y en muestras biológicas. El foco principal se ha dirigido a muestras biológicas topográficamente complejas, estructuralmente ricas y con propiedades dieléctricas heterogéneas, tales como las células. No solo eso, sino que nuestro objetivo es abrir nuevas vías en el campo de la caracterización eléctrica a la nanoescala, que van desde el mapeo de la constante dieléctrica hasta la exploración de la conductividad de las muestras y de la extracción de información tomográfica, así como desarrollar nuevas herramientas que faciliten el uso de este tipo de microscopía. Los resultados de la tesis se presentan en 5 publicaciones más un trabajo en preparación, las cuales mediante cada una de ellas se llega a los diferentes objetivos de la tesis. Primeramente, se realizan mapas de capacitancia en capas autoensambladas en líquido, en el que se incluyen los efectos interfaciales de la sonda de medida y los fenómenos de perdida de señal en in-liquid SDM, lo que permitió medir las propiedades dieléctricas de capas autoensambladas sobre oro de pocos átomos de espesor. Seguidamente, estudiamos la composición de células eucariotas mediante la microscopia dieléctrica combinando con aprendizaje automático en el que generalizamos la reconstrucción topográfica para la aplicación de la técnica de SDM a muestras grandes. El tercer trabajo fue enfocado a la caracterización eléctrica de extensiones de membrana de Shewanella oneidensis que

presentan una topografía y composición compleja y en el que aplicamos los desarrollos hechos para combinar en el análisis la conductividad y la reconstrucción topográfica. En la cuarta se extiende la técnica de in-liquid SDM a muestras biológicas complejas con conductividad y fue aplicado a liposomas como un modelo celular. En el quinto trabajo, se realizan imágenes eléctricas en células fijadas en medio líquido en condiciones quasi­ fisiológicas. Finalmente, en el trabajo en preparación se aumentó la capacidad de medir en medios altamente conductores, necesario para cumplir con el objetivo de hacer medida en células vivas.

[eng] The dielectric properties of cells have been the subject of intense research over the years due to their relevance to many fundamental biological problems. Scanning Probe Microscopy (SPM) techniques based on electrical force measurement, such as Scanning Dielectric Microscopy (SDM), offer an alternative route to map the dielectric properties of cells. However, the extension of this approach to cells in physiological liquid conditions is not immediate, as SDM in liquids triggers a complex frequency- and voltage-dependent response and requires new quantification methods to take into account the complex topography exhibited by biological samples. The thesis aims at developing advanced in liquid-SDM methods to overcome the capabilities of currently existing methods for the study of the electrical properties of cells and biological samples at the nanoscale in physiological conditions, accounting of their complex topography, rich inner structure and heterogeneous distribution of the dielectric properties. The results of the thesis are presented in 5 publications plus a work in preparation, each of which achieves different partial objectives of the thesis. Firstly, capacitance maps in liquid of self-assembled monolayers a few atoms thick are carried out. Next, the dielectric composition mapping of fixed dry eukaryotic cells is performed combining scanning dielectric microscopy and machine learning. The third work is focused on the electrical characterization of membrane extensions of Shewanella oneidensis that present a complex topography and composition and in which we applied the developments made to combine conductivity and topographic reconstruction in the analysis. In the fourth, the in-liquid SDM technique is extended to complex biological samples with conductivity and was applied to liposomes as a cellular model. In the fifth paper, electrical imaging is performed on cells fixed in liquid medium under quasi-physiological conditions. Finally, in the work in preparation, the ability to measure in highly conductive media, necessary to meet the goal of measuring in living cells, was achieved.