Protein-Based Targeted Delivery Systems for Antimicrobial Photodynamic Inactivation

Abstract

Des de la introducció dels antibiòtics, els microorganismes han començat a desenvolupar resistència a ells i, avui dia, a causa de l'abús d'aquests fàrmacs i la manca de descobriment de noves classes d'antibiòtics, la resistència antimicrobiana és una de les amenaces més urgents per a la salut pública mundial.

Entre els microorganismes, la resistència bacteriana als antibiòtics és una “pandèmia silenciosa” que el 2019 va provocar la mort de gairebé 5 milions de persones i, sense accions i innovacions, el 2050 la taxa de mortalitat pujarà a 10 milions. Des d'aquest punt de vista, un dels bacteris més preocupants és S. aureus, classificat per l'OMS com a bacteri d'alta prioritat.

L'objectiu d'aquest projecte és desenvolupar complexos supramoleculars per a la teràpia fotodinàmica antimicrobiana dirigida contra bacteris (aPDT), en particular S. aureus.

La PDT és una tècnica prometedora per oposar la resistència als antibiòtics gràcies a la seva ràpida acció i capacitat per apuntar diferents biomolècules. Per tant, no s'espera que els microorganismes desenvolupin resistència a la aPDT.

La PDT es basa en l'ús de fotosensibilitzadors (PSs), és a dir, molècules que poden ser excitades per la llum visible d'una longitud d'ona adequada i, a partir dels estats excitats, generar espècies reactives d'oxigen tòxiques per a la cèl·lula objectiu. Després de la fotoexcitació a un estat electrònic excitat, un PS normalment pateix la transició a l'estat triplet, que pot interactuar amb l'oxigen molecular de dues maneres diferents, per transferència d'electrons (tipus I) o per transferència d'energia (tipus II), fet que porta a la formació d'espècies reactives d'oxigen (radicals i oxigen singlet, respectivament). Aquestes espècies altament reactives tenen una acció citotòxica, en danyar les macromolècules biològiques presents a les cèl·lules, cosa que porta a la mort cel·lular.

Usant un enfocament modular, en aquest treball, hem desenvolupat complexos supramoleculars capaços de transportar el PS a la cèl·lula objectiu. Aquests complexos consten de tres components: el PS, el sistema d'unió i el sistema d'orientació. El PS provoca una acció fotocitotòxica quan s'exposa a la llum visible, i el sistema d'unió, format per estreptavidina (una proteïna tetramèrica) i biotina (una vitamina), connecta el PS al sistema d'orientació que permet que la unitat fotoactiva sigui transportada cap a les cèl·lules objectiu.

Triem aquest enfocament perquè és inherentment flexible. Els PSs poden modificar-se afegint-los un grup químic apropiat que sigui reactiu amb les cadenes laterals dels aminoàcids (Lys, Cys, …) i per tant els permeti unir-se a les proteïnes, en el nostre cas l'estreptavidina. Depenent del tipus de molècula/cèl·lula objectiu, es pot triar una proteïna d'encaminament adequada que es pot funcionalitzar amb la biotina. Al final, aprofitant l'alta afinitat entre l'estreptavidina i la biotina, és possible unir les dues parts (PS-estreptavidina i molècula diana biotinilada) per formar el complex supramolecular.

Hem construït i caracteritzat dos complexos diferents: un que té l'eosina com a PS i l'anticòs immunoglobulina G (IgG) com a sistema d'orientació i un altre que explota el blau de metilè com a PS i la proteïna concanavalina A (ConA) com a sistema d'orientació.

Usant anisotropia de fluorescència i FCS, confirmem que tots dos els PSs (EITC i MB, respectivament) estan units a estreptavidina.

Caracteritzem algunes propietats fotofísiques d'EITC-estreptavidina i MB-estreptavidina i, en tots dos casos, observem que quan el PS s'uneix a la proteïna, tots els rendiments quàntics (de fluorescència, formació d'estat triplet i formació d'oxigen singlet) disminueixen. A més, amb l'estreptavidina marcada amb EITC notem que els rendiments quàntics disminueixen amb l'augment del nombre de molècules de PS presents a la mateixa proteïna.

Usant FCS, confirmem que l'estreptavidina marcada s'uneix al sistema d'adreçament biotinilat (IgG i ConA, respectivament) i que aquest últim és necessari per apuntar els bacteris; això es va confirmar a més mitjançant la fotoinactivació en què, en absència del sistema d'orientació, la mort cel·lular va ser ordres de magnitud menor (al voltant de 4 log).

Els mesuraments microscòpics van mostrar que el primer complex apunta selectivament a S. aureus, mentre que el segon apunta tant a S. aureus com a E. coli.

Al final, en realitzar proves de fotoinactivació, vam obtenir una mort cel·lular eficient contra S. aureus amb el primer complex (8 log amb EITC 2 µM i 50 J/cm2) i una mort cel·lular equivalent tant per a S. aureus com per a E. coli amb el segon complex (4 log amb 5 µM de MB i 200 J/cm2).

Desde la introducción de los antibióticos, los microorganismos han comenzado a desarrollar resistencia a ellos y, hoy en día, debido al abuso de estos fármacos y a la falta de descubrimiento de nuevas clases de antibióticos, la resistencia antimicrobianaes una de las amenazas más urgentes para la salud pública mundial.

Entre los microorganismos, la resistencia bacteriana a los antibióticos es una “pandemia silenciosa” que en 2019 provocó la muerte de casi 5 millones de personas y, sin acciones e innovaciones, en 2050 la tasa de mortalidad ascenderá a 10 millones. Desde este punto de vista, una de las bacterias más preocupantes es S. aureus, clasificado por la OMS como bacteria de alta prioridad.

El objetivo deeste proyecto es el desarrollo de complejos supramoleculares para la terapia fotodinámica antimicrobiana dirigida contra bacterias (aPDT), en particular S. aureus.

La PDT es una técnica prometedora para opondrar la resistencia a los antibióticos gracias a su rápida acción y su capacidad para apuntar diferentes biomoléculas. Por lo tanto, no se espera que los microorganismos desarrollen resistencia a la aPDT.

La PDT se basa en el uso de fotosensibilizadores (PSs), es decir, moléculas que pueden ser excitadas por la luz visible de una longitud de onda adecuada y, a partir de los estados excitados, generar especies reactivas de oxígeno tóxicas para la célula diana. Después de la fotoexcitación a un estado electrónico excitado, un PS normalmente sufre la transición al estado triplete, que puede interactuar con el oxígeno molecular de dos maneras diferentes, por transferencia de electrones (tipo I) o por transferencia de energía (tipo II), lo que lleva a la formación de especies reactivas de oxígeno (radicales y oxígeno singlete, respectivamente). Estas especies altamente reactivas tienen una acción citotóxica, al dañar las macromoléculas biológicas presentes en las células, lo que lleva a la muerte celular.

Usando un enfoque modular, en este trabajo, hemos desarrollado complejos supramoleculares capaces de transportar el PS a la célula diana. Estos complejos constan de tres componentes: el PS, el sistema de empalme y el sistema de direccionamiento. El PS provoca una acción fotocitotóxica cuando se expone a la luz visible, y el sistema de empalme, formado por estreptavidina (una proteína tetramérica) y biotina (una vitamina), conecta el PS al sistema de direccionamiento que permite que la unidad fotoactiva sea transportada hacia las células diana.

Elegimos este enfoque porque es inherentemente flexible. Los PSs pueden modificarse añadiéndoles un grupo químico apropiado que sea reactivo con las cadenas laterales de los aminoácidos (Lys, Cys, …) y por tanto los permita unirse a las proteínas, en nuestro caso la estreptavidina. Dependiendo del tipo de molécula/célula diana, se puede elegir una proteína de direccionamiento adecuada que se puede funcionalizar con la biotina. En el final, aprovechando la alta afinidad entre la estreptavidina y la biotina, es posible unir las dos partes (PS-estreptavidina y molécula diana biotinilada) para formar el complejo supramolecular.

Hemos construido y caracterizado dos complejos diferentes: uno que tiene la eosina como PS y el anticuerpo inmunoglobulina G (IgG) como sistema de direccionamiento y otro que explota el azul de metileno como PS y la proteína concanavalina A (ConA) como sistema de direccionamiento.

Usando anisotropía de fluorescencia y FCS, confirmamos que ambos los PSs (EITC y MB, respectivamente) están unidos a estreptavidina.

Caracterizamos algunas propiedades fotofísicas de EITC-estreptavidina y MB-estreptavidina y, en ambos casos, observamos que cuando el PS se une a la proteína, todos los rendimientos cuánticos (de fluorescencia, formación de estado triplete y formación de oxígeno singlete) disminuyen. Además, con la estreptavidina marcada con EITC notamos que los rendimientos cuánticos disminuyen con el aumento del número de moléculas de PS presentes en la misma proteína.

Usando FCS, confirmamos que la estreptavidina marcada se une al sistema de direccionamiento biotinilado (IgG y ConA, respectivamente) y que este último es necesario para apuntar las bacterias; esto se confirmó además mediante la fotoinactivación en la que, en ausencia del sistema de direccionamiento, la muerte celular fue órdenes de magnitud menor (alrededor de 4 log).

Las mediciones microscópicas mostraron que el primer complejo apunta selectivamente a S. aureus, mientras que el segundo apunta tanto a S. aureus como a E. coli.

En el final, al realizar pruebas de fotoinactivación, obtuvimos una muerte celular eficiente contra S. aureus con el primer complejo (8 log con EITC 2 µM y 50 J/cm2) y una muerte celular equivalente tanto para S. aureus como para E. coli con el segundo complejo (4 log con 5 µM de MB y 200 J/cm2).

Since the introduction of antibiotics, microorganisms have started to develop resistance to them and nowadays, due to the abuse of these drugs and the lack of discovery of new classes of antibiotics, antimicrobial resistance is one of the most pressing threats for world public health.

Among microorganisms, bacterial resistance to antibiotics is a “silent pandemic” that in 2019 led to the deaths of nearly 5 million people and, without actions and innovations, in 2050 the death rate will rise to 10 million. From this point of view, one of the most worrying bacteria is S. aureus, classified by the WHO as a high priority bacterium.

The aim of this project is to develop supramolecular complexes for targeted antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) against bacteria, in particular S. aureus.

aPDT is a promising technique for countering antibiotic resistance thanks to its fast action and its ability to target different biomolecules. Therefore, microorganisms are not expected to develop resistance to aPDT.

PDT is based on the use of photosensitizers (PS), i.e. molecules that can be excited by visible light of appropriate wavelength and, from the excited states, generate reactive oxygen species that are toxic for the target cell. After photoexcitation to an electronically excited state, a PS normally undergoes transition to the triplet state, which can interact with molecular oxygen in two different ways, by electron transfer (type I) or by energy transfer (type II), leading to the formation of reactive oxygen species (radicals and singlet oxygen, respectively). These highly reactive species have a cytotoxic action, through damage to biological macromolecules present in cells, leading to cell death.

Using a modular approach, in this work, we developed supramolecular complexes that are able to deliver the PS to the target cell. These complexes are formed by three components: the PS, the junction system and the targeting system. The PS elicits the photocytotoxic action when exposed to visible light, and the junction system, formed by streptavidin (a tetrameric protein) and biotin (a vitamin), connect the PS to the targeting system which allows to drive the photoactive unit towards the target cells.

We chose this approach because it is inherently flexible. PSs can be modified by adding to them an appropriate chemical group that is reactive towards amino acid side chains (Lys, Cys, …) and thus allows binding them to proteins, in our case streptavidin. Depending on the target molecule/cell type, it is possible to choose an appropriate targeting protein that can be functionalized with biotin. Finally, by exploiting the high affinity between streptavidin and biotin, it is possible to link the two parts (PS-streptavidin and biotinylated targeting molecule) to form the supramolecular complex.

We have created and characterized two different complexes: one that has eosin as PS and the antibody Immunoglobulin G (IgG) as targeting system and one that contains methylene blue as a PS, and the protein concanavalin A (ConA) as the targeting system.

Using fluorescence anisotropy and FCS we confirmed that both the PSs (EITC and MB, respectively) are bound to streptavidin.

We characterized some photophysical properties of EITC-streptavidin and MB-streptavidin, and in both cases, we observed that when the PS is bound to the protein, all quantum yields (of fluorescence, triplet state formation and singlet oxygen formation) decrease. Furthermore, with the EITC-labeled streptavidin we noticed that the quantum yields decrease as the number of PS molecules present on the same protein increase.

Using FCS we confirmed that labeled streptavidin bound to biotinylated targeting system (IgG and ConA, respectively) and that the latter is required to target bacteria; this was further confirmed by the photoinactivation where in absence of the targeting system the cell death was orders of magnitude lower (around 4 logs).

Microscopy measurements showed that the first complex selectively target S. aureus, while the second one target both S. aureus and E. coli.

Finally, performing photoinactivation tests we obtained an efficiently cell death against S. aureus with the first complex (8 logs with 2 µM of EITC and 50 J/cm2) and an equivalent cell death for both S. aureus and E. coli with the second complex (4 logs with 5 µM of MB and 200 J/cm2).