Desarrollo de nuevos métodos para el análisis del polifosfato en células humanas

Abstract

Nombre / Nom / Name Ana Apellidos / Cognoms / Surname Sarrias Giménez Dirección de correo electrónico / Adreça de correu electrònic / email address (opcional / optional) anasargim@gmail.com Departamento / Departament / Department Ciencias Básicas Área de conocimiento / Àrea de coneixement / Field of knowledge Ciencias biomédicas Director/s de Tesis / Thesis supervisor/s Samuel Bru Rullo Dirección de correo electrónico director / Adreça de correu electrònic director / Supervisor/s' email address (opcional / optional) sbru@uic.es Fecha de defensa / Data de defensa / Defense date (dd/mm/yyyy) 19/07/2023 Título / Títol / Title Desarrollo de nuevos métodos para el análisis del polifosfato en células humanas Lengua / Llengua / Language Castellano Palabras clave / Paraules clau / Key words (máx. 10) Polifosfato, PolyP, células humanas, NUDT3, purificación bioquímica, inmunofluorescencia, microscopía. Acepto la publicación del fichero de mi tesis en Internet / Accepto la publicació del fitxer de la meva tesi a Internet / I accept that my thesis file is published on the Internet (indicar sí o no / write yes or no) En el cas d’indicar NO, l’embargament serà per un màxim de 24 mesos / En caso de indicar NO, el embargo será por un máximo de 24 meses / If you indicate NO, the attachment will be for a maximum of 24 months. Si Resumen / Resum / Abstract Dar el resumen en la lengua del documento. / Escriu el resum en la llengua del document / Write the abstract in the language of the document Si la lengua del documento no es el catalán, darlo opcionalmente también en esta lengua./ Si la llengua del document no és el català, escriure opcionalment també en català / If the language of the document is not Catalan, optionally write it in Catalan as well).

El polifosfato (polyP) es una molécula lineal compuesta por cientos de residuos de fosfato unidos por enlaces fosfoanhídrido. Se encuentra presente en un amplio rango de organismos, y, en humanos, posee gran variedad de funciones relacionadas con la coagulación sanguínea, la osteogénesis, el Alzheimer o el cáncer. A pesar de su importancia biológica, el estudio del polyP en humanos se enfrenta a varias barreras. En primer lugar, su concentración en mamíferos es considerablemente baja, aproximadamente mil veces inferior que en organismos unicelulares. Además, la falta de información acerca de las enzimas implicadas en la síntesis y degradación de esta molécula en células humanas dificulta su estudio. Por último, se desconoce la cantidad y localización del polyP en células humanas y los pocos estudios que hay a menudo son contradictorios, mostrando diferentes localizaciones del polyP dentro de la célula. Para poder estudiar y analizar el metabolismo del polyP en células humanas es necesario desarrollar nuevas técnicas que permitan su estudio y cuantificación. En esta tesis doctoral se presentan 3 métodos de detección: la visualización por inmunofluorescencia, la visualización in vivo mediante live cell imaging y la purificación bioquímica de la molécula. La detección por inmunofluorescencia se realizó mediante el uso del PPBD y se pudo validar la señal tanto in vitro, mediante la incubación con Ppx1, como in vivo, mediante la sobreexpresión de NUDT3. La visualización in vivo se intentó validar con la misma estrategia, pero no se pudo probar que la señal obtenida fuera específica de polyP. Por último, se procedió a la validación de todos los pasos necesarios para la purificación bioquímica, y se realizó un estudio minucioso de varios factores que podrían influir en la cuantificación del polyP purificado. A través de esta técnica, se lograron obtener niveles de polyP celular más elevados que los descritos hasta ahora en la literatura científica. Siguiendo este protocolo, se logró purificar polyP de varias líneas celulares humanas de diferentes tejidos (pulmón, cerebro, colon y mama) y se llevó a cabo un estudio de las diferentes cantidades de polyP en cada línea celular. Además, se pudo localizar el polyP mediante inmunofluorescencia, encontrando diferencias tanto en la concentración como en localización del polyP entre las diferentes líneas. Se observó que dichas diferencias correlacionan con los patrones de expresión de las polifosfatasas PRUNE1 y NUDT3. Tras esto, y para investigar las variaciones del polyP en diferentes condiciones adversas para la célula, se realizaron estudios en condiciones de privación de nutrientes, utilizando medios de cultivo con diferentes cantidades de glucosa, fosfato, y en hipoxia. Los resultados demostraron que la cantidad de polyP celular disminuye en condiciones de privación de nutrientes. Asimismo, se estudió la dinámica del polyP frente al daño al ADN, realizando estudios de viabilidad tras modificar los niveles de polyP celular y tratar las células con cisplatino. Se observó que cuando la célula tiene sus niveles de polyP reducidos, su supervivencia frente al daño al ADN se ve afectada. Finalmente, se intentó purificar polyP de tejidos de ratón mediante el protocolo previamente descrito en esta tesis, pero sin éxito. En conclusión, esta tesis presenta dos métodos para la detección de polyP en células humanas y aporta nueva información sobre el metabolismo de esta molécula en diferentes líneas celulares y diversas condiciones metabólicas.