Dealing with the main challenges of fanconi anemia molecular diagnosis and therapy

Abstract

L'anèmia de Fanconi (FA) és un trastorn genètic rar de la reparació de l'ADN amb àmplia heterogeneïtat genètica, múltiples mutacions privades i alta taxa de mosaïcisme, que encara prejutgen el diagnòstic molecular en el cas de variants de difícil caracterització o de patogenicitat dubtosa. Els pacients amb FA també presenten insuficiència de la medul·la òssia i més susceptibilitat a tumors sòlids i neoplàsies hematològiques. Atès que els tractaments actuals només aborden els defectes hematopoètics, és indispensable trobar noves teràpies farmacològiques sistèmiques a FA. Intentem fer front a aquests obstacles a través de: i. Disseny d'una estratègia optimitzada de cribratge mutacional basada en seqüenciació dirigida de nova generació (t-NGS) i tècniques complementàries per a un diagnòstic molecular de FA més ràpid i exhaustiu. Caracteritzem 14/14 subjectes pertanyents a tres grups de complementació diferents, i reportem un total de 23 al·lels genèticament diferents, inclòs un de fundador. També desenvolupem una anàlisi estadística per inferir variants de número de còpia (CNVs) a partir de les dades de NGS i, per a les 5 delecions pronosticades, proporcionem taxes de detecció coincidents amb les de les tècniques de referència per a l'estudi de CNVs. A més, descrivim el cas d'un pacient amb una gran deleció i una variant de splicing coneguda compensada per una inserció de novo, resultant en un efecte potencial de teràpia gènica natural in vivo. ii. Validació de sistemes cel·lulars de tres proteïnes FANCA mutades però estables (Arg951Gln, Thr1131Ala, Phe1263del), aptes per a un cribratge d'alt contingut de fàrmacs, per tal d'identificar molècula/es capaços de rescatar-ne els fenotips. Per generar els models, transduïm vectors lentivirals amb les mutacions en una línia deficient per a FANCA que expressa una proteïna FANCD2 fluorescent. Aquestes cèl·lules no són capaces de monoubiquitinar FANCD2 o promoure'n la reubicació en focus de reparació de l'ADN, característiques pròpies de l'activitat de la ruta FA. Tot i confirmar l'expressió de la proteïna FANCA mutant en tots els models, només el del mutant Phe1263del va mostrar un fenotip cel·lular compatible amb la línia deficient per a FANCA; per contra, els altres dos models amb comportament de tipus salvatge es van descartar com a candidats per a l'HCS. Posteriorment, monitoritzarem la correcció de Phe1263del a través de la formació de focus FANCD2 fluorescents amb l'objectiu de trobar un fàrmac, possiblement ja aprovat per la Food and Drug Administration (FDA), per a una teràpia mutació- dependent personalitzada per a tots els trets clínics de FA. iii. Realització de cribratges CRISPR KO a tot el genoma per disseccionar noves interaccions sintètiques (SIs) amb els gens FA.Transduïm una línia FANCA deficient i el seu control, tots dos caracteritzats per l'expressió de Cas9, amb dues llibreries KO d'ARN guia (gRNA), una llibreria generada al laboratori (“llibreria interna”) i una comercial anomenada Toronto KO version 3 (TKOv3). Durant els cribratges no vam introduir cap estímul extern, a fi d'analitzar els fenotips resultants de la competència proliferativa entre les cèl·lules sotmeses a supressió genètica. Per mantenir la representació de gRNAs/fenotips els cribratges van ser detinguts després de 10 duplicacions cel·lulars, després d'això vam aïllar l'ADN de totes les rèpliques i l'amplifiquem amb encebadors amb codi de barres per a NGS. A continuació, es va dur a terme l'anàlisi bioinformàtica i estadística del cribratge de la “llibreria interna”, redactant una llista preliminar de gens amb baixa representació (SI letals) i enriquits (SI viables). Compararem aquests resultats amb els de seqüenciació del cribratge amb la TKOv3 i validarem els millors candidats per provar les SIs. L'assoliment dels objectius d'aquest projecte de tesi proporcionarà una estratègia integral per als desafiaments actuals d'AF, des del laboratori fins al llit del pacient i tornada.

La anemia de Fanconi (FA) es un trastorno genético raro de la reparación del ADN con amplia heterogeneidad genética, múltiples mutaciones privadas y alta tasa de mosaicismo, que todavía prejuzgan el diagnóstico molecular en el caso de variantes de difícil caracterización o de patogenicidad dudosa. Los pacientes con FA también presentan insuficiencia de la medula ósea y mayor susceptibilidad a tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Dado que los tratamientos actuales solo abordan los defectos hematopoyéticos, es indispensable encontrar nuevas terapias farmacológicas sistémicas en FA. Intentamos hacer frente a estos obstáculos a través de: i. Diseño de una estrategia optimizada de cribado mutacional basada en secuenciación dirigida de nueva generación (t-NGS) y en técnicas complementarias para un diagnóstico molecular de FA más rápido y exhaustivo. Caracterizamos 14/14 sujetos pertenecientes a tres grupos de complementación diferentes, y reportamos un total de 23 alelos genéticamente distintos, incluido uno fundador. También desarrollamos un análisis estadístico para inferir variantes de numero de copia (CNVs) a partir de los datos de NGS y, para las 5 deleciones pronosticadas, proporcionamos tasas de detección coincidentes con las de las técnicas de referencia para el estudio de CNVs. Además, describimos el caso de un paciente con una gran deleción y una variante de splicing conocida compensada por una inserción de novo, resultando en un potencial efecto de terapia génica natural in vivo. ii. Validación de sistemas celulares de tres proteínas FANCA mutadas pero estables (Arg951Gln, Thr1131Ala, Phe1263del), aptos para un cribado de alto contenido de fármacos, con el fin de identificar molécula/s capaces de rescatar sus fenotipos. Para generar los modelos, transducimos vectores lentivirales con las mutaciones en una línea deficiente para FANCA que expresa una proteína FANCD2 fluorescente. Estas células no son capaces de mono-ubiquitinar FANCD2 o promover su reubicación en focos de reparación del ADN, características propias de la actividad de la ruta FA. A pesar de confirmar la expresión de la proteína FANCA mutante en todos los modelos, solo el del mutante Phe1263del mostró un fenotipo celular compatible con la línea deficiente para FANCA; por el contrario, los otros dos modelos con comportamiento de tipo salvaje se descartaron como candidatos para el HCS. Posteriormente, monitorearemos la corrección de Phe1263del a través de la formación de focos FANCD2 fluorescentes con el objetivo de encontrar un fármaco, posiblemente ya aprobado por la Food and Drug Administration (FDA), para una terapia mutación- dependiente personalizada para todos los rasgos clínicos de FA. iii. Realización de cribados CRISPR KO en todo el genoma para diseccionar nuevas interacciones sintéticas (SIs) con los genes FA. Transducimos una línea FANCA deficiente y su control, ambos caracterizados por la expresión de Cas9, con dos librerías KO de ARN guía (gRNA), una librería generada en laboratorio (“librería interna”) y una comercial denominada Toronto KO version 3 (TKOv3). Durante los cribados no introdujimos ningún estimulo externo, con el fin de analizar los fenotipos resultantes de la competencia proliferativa entre las células sometidas a supresión genética. Para mantener la representación de gRNAs/fenotipos los cribados fueron detenidos después de 10 duplicaciones celulares, tras lo cual aislamos el ADN de todas las réplicas y lo amplificamos con cebadores con código de barras para NGS. A continuación, se llevó a cabo el análisis bioinformático y estadístico del cribado de la “librería interna”, redactando una lista preliminar de genes con baja representación (SI letales) y enriquecidos (SI viables). Compararemos estos resultados con los de secuenciación del cribado con la TKOv3 y validaremos los mejores candidatos para probar las SIs. El logro de los objetivos de este proyecto de tesis proporcionará una estrategia integral para los actuales desafíos de AF, desde el laboratorio hasta la cama del paciente y vuelta.

Fanconi anemia (FA) is a rare genetic DNA repair deficiency with vast genetic heterogeneity, multiple private mutations, and high mosaicism rate, still jeopardizing molecular diagnosis in case of variants with difficult characterization or unclear pathogenicity. FA also shows bone marrow failure and enhanced susceptibility to hematologic and solid malignancies. Since current treatments only address hematopoietic defects, it is essential to find new systemic drug-based therapies for FA patients. We sought to cope with these hurdles through: i. Design of an optimized mutation screening strategy based on targeted next generation sequencing and complementary techniques for a faster and exhaustive FA molecular diagnosis. We successfully characterized 14/14 patients from three different complementation groups, and reported a total of 23 genetically distinct alleles, including a founder one. We also developed a statistical analysis to infer copy-number variants (CNVs) from the NGS data, and, for all the 5 gross deletions predicted, we provided detection rates matching with those of CNVs gold standards. Moreover, we described the case of a patient with a large deletion and a known splicing variant compensated by a de novo insertion, elucidating a presumptive natural gene therapy phenomenon in vivo. ii. Validation of cellular systems expressing three stable, but defective FANCA proteins (Arg951Gln, Thr1131Ala, Phe1263del) suitable for high content screening (HCS) to identify drug/s able to rescue mutants’ phenotypes. To generate the models, we transduced lentiviral vectors carrying the mutations into a FANCA-deficient line that expresses a fluorescent FANCD2 protein. These cells are unable to mono-ubiquitinate FANCD2 or promote its relocation to DNA repair foci, both hallmarks of FA pathway activity. Despite confirming mutant FANCA expression in all models, only the Phe1263del one exhibited a cellular phenotype compatible with the FANCA-null line; the other wild-type behaving mutants were instead discarded as HCS candidates. We will next monitor Phe1263del correction via fluorescent FANCD2 foci formation with the aim of finding a drug, possibly already approved by the Food and Drug Administration (FDA), for a personalized mutation-dependent therapy towards all FA clinical features. iii. Performance of genome-wide (GW) clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) knockout (KO) screens to dissect novel synthetic interactions (SIs) with FA deficiency. We transduced CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-expressing FANCA-deficient and control lines with two GW KO libraries of guide RNAs (gRNAs), i.e., an in-house and the commercial Toronto KO version 3 (TKOv3) library. Over the screens we did not apply any biological challenge in order to analyze the end phenotypes deriving from the i proliferative competition between the cells subjected to gene KO. To keep gRNAs/phenotypes representation, screens were ended at ~10 cell doublings, and genomic DNA from all replicates was isolated and amplified with barcode-tagged primers for NGS. Bioinformatic and statical analyses have already been run for the in- house library screen, providing a preliminary roster of depleted (lethal SIs) and enriched (viable SIs) hits. Subsequently, we will contrast these results with those of the TKOv3 screen sequencing and validate the best hits to prove the SIs detected and, thus, provide novel druggable targets for FA treatment (viable SIs) and/or new indications for gene alterations sensitizing cancer cells to the inhibition of FA pathway or its interactors (lethal SIs). The achievement of the goals of this thesis project will provide a comprehensive strategy for the current challenges of FA, proceeding from the bench to the bedside and back.