Interacción de micobacterias no tuberculosas con microorganismos patógenos. Características fisiológicas y modulación de la respuesta inmune en modelos in vitro e in vivo

Abstract

Els micobacteris no tuberculosos es troben al medi ambient, en sòls o entorns aquàtics, en què creixen sense necessitar un hospedador, al contrari del que passa en les espècies patògenes intracel·lulars obligades que causen malaltia com la tuberculosi o la lepra. Hi ha més de 150 espècies de micobacteris no tuberculoses descrites de les quals la majoria no són patògenes, encara que algunes espècies són patògens oportunistes. La incidència d'infeccions degudes als micobacteris no tuberculosos s'ha incrementat de manera continuada en els darrers anys. El coneixement sobre els micobacteris no tuberculosos és reduït en comparació amb el que es coneix dels micobacteris que causen malaltia, i especialment en el cas del Mycobacterium tuberculosis.

Conèixer la possible interacció dels micobacteris no tuberculosos amb microorganismes patògens i el rol d'aquests micobacteris en la modulació del sistema immune de l'hoste, podrien proporcionar-nos eines per evitar infeccions o per al seu ús com a moduladors del sistema immune. L'objectiu d'aquesta tesi és caracteritzar diferents aspectes dels micobacteris no tuberculosos innocus i patògens oportunistes que permetin manifestar la seva rellevància clínica i immunomoduladora.

Un aspecte poc estudiat en micobacteris no tuberculosos és la formació d'inclusions lipídiques intracel·lulars. Al M. tuberculosis aquestes inclusions suposen una font d'energia per a la persistència a l'hoste, entrada en estat de latència o resistència a antibiòtics. En aquesta tesi es descriuen i caracteritzen mitjançant tècniques de microscòpia electrònica les inclusions lipídiques desenvolupades pel Mycobacterium brumae, una espècie ambiental no patògena amb un efecte immunomodulador conegut, demostrant que el desenvolupament d'inclusions lipídiques no és exclusiu d'espècies patògenes i que contenen una composició lipídica similar a les del M. tuberculosis.

La transformació de micobacteris no tuberculosos amb material genètic exogen és molt limitada a conseqüència del gruix i complexitat de la paret cel·lular que dificulta enormement la incorporació de l'ADN. Per això, aquesta tesi desenvolupa un procediment que millora les eficiències d'electroporació en micobacteris ambientals inhibint els sistemes de restricció-modificació, dessalant l'ADN transformant i disgregant eficaçment els agregats de micobacteris.

Les infeccions oportunistes que produeixen alguns micobacteris no tuberculosos es desenvolupen majoritàriament a les vies respiratòries i el Mycobacterium abscessus és l'espècie que s'aïlla amb més assiduïtat i la incidència de la qual s'està incrementant en pacients amb malalties pulmonars cròniques, especialment en casos de fibrosi quística. La presència del M. abscessus està acompanyada per altres bacteris patògens que coinfecten els pulmons, sent el Pseudomonas aeruginosa el bacteri patogènic més freqüent en aquest context. La coinfecció de les vies respiratòries pels M. abscessus i P. aeruginosa incrementa significativament la morbiditat i mortalitat dels pacients per la seva capacitat formadora de biofilms. Aquesta tesi desenvolupa un mètode de quantificació de biofilms estàtics utilitzant soques fluorescents i bioluminiscents, que demostra la coexistència i estabilitat de les dues espècies en biofilms duals. Infectant cèl·lules epitelials bronquials in vitro, es descriu que la coinfecció pels M. abscessus i P. aeruginosa disminueix la resposta immune induïda respecte a la produïda en infeccions individuals. Similarment, s'observen efectes de repressió sobre la immunitat innata in vivo de larves de G. mellonella coinfectades a nivell de producció de pèptids antimicrobians, enzims i proteïnes antimicrobianes.

Finalment, s'estudia la capacitat de determinades espècies de micobacteris no tuberculosos, i particularment del M. brumae, de modular el sistema immune de l'hoste utilitzant el model in vivo de larves de G. mellonella, per protegir-lo davant de la infecció per diferents microorganismes patògens. Així, es demostra que l'exposició al M. brumae resulta eficaç en la contenció de posteriors infeccions per bacteris letals per a l'insecte. Aquesta protecció està mediada per cascades de senyalització activades pel M. brumae que indueixen una elevada resposta immune innata de l'insecte.

Las micobacterias no tuberculosas se encuentran en el medio ambiente; en suelos o entornos acuáticos, en los que crecen sin necesitar un hospedador, al contrario que las especies patógenas intracelulares obligadas que causan enfermedad como tuberculosis o lepra. Existen más de 150 especies de micobacterias no tuberculosas descritas de las cuales la mayoría no son patógenas, aunque algunas especies pueden ser patógenas oportunistas. La incidencia de infecciones debidas a micobacterias no tuberculosas se ha incrementado de manera continuada en los últimos años. El conocimiento sobre las micobacterias no tuberculosas es reducido en comparación con las micobacterias que causan enfermedad, y especialmente en Mycobacterium tuberculosis.

Conocer la posible interacción de las micobacterias no tuberculosas con microorganismos patógenos y el rol de éstas en la modulación del sistema inmune del huésped, podría proporcionarnos herramientas claves para evitar infecciones o para su uso como moduladores del sistema inmune. El objetivo de esta tesis es caracterizar diferentes aspectos de micobacterias no tuberculosas inocuas y patógenas oportunistas que permitan manifestar su relevancia clínica e inmunomoduladora.

Un aspecto poco estudiado en micobacterias no tuberculosas es la formación de inclusiones lipídicas intracelulares. En M. tuberculosis estas inclusiones suponen una fuente de energía para la persistencia en el huésped, entrada en estado de latencia o resistencia a antibióticos. Esta tesis describe y caracteriza mediante técnicas de microscopía electrónica las inclusiones lipídicas desarrolladas por Mycobacterium brumae, una especie ambiental no patógena con conocido efecto inmunomodulador, demostrando que el desarrollo de inclusiones lipídicas no es exclusivo de especies patógenas y que contienen una composición lipídica similar a M. tuberculosis.

La transformación de micobacterias no tuberculosas con material genético exógeno es muy limitada a consecuencia del grosor y complejidad de su pared celular lo que dificulta enormemente la incorporación de ADN. Por ello, esta tesis desarrolla un procedimiento que mejora las eficiencias de electroporación en micobacterias ambientales inhibiendo los sistemas de restricción-modificación, desalando el ADN transformante y estableciendo un mecanismo para disgregar eficazmente los agregados de micobacteria.

Las infecciones oportunistas que producen algunas micobacterias no tuberculosas se desarrollan mayoritariamente en las vías respiratorias, siendo Mycobacterium abscessus la especie aislada con mayor asiduidad y cuya incidencia ha incrementado en los últimos años en pacientes con enfermedades pulmonares crónicas, especialmente relevante en enfermos con fibrosis quística. La presencia de M. abscessus está acompañada por otras bacterias patógenas que coinfectan los pulmones, siendo Pseudomonas aeruginosa la bacteria patógena más frecuente en este contexto. La coinfección de las vías respiratorias por M. abscessus y P. aeruginosa incrementa significativamente la morbilidad y mortalidad de los pacientes por su capacidad formadora de biofilms. Esta tesis desarrolla un método de cuantificación de biofilms estáticos utilizando cepas fluorescentes y bioluminiscentes, que demuestra la coexistencia y estabilidad de ambas especies en biofilms duales. Además, infectando células epiteliales bronquiales in vitro, se describe que la coinfección por M. abscessus y P. aeruginosa disminuye la respuesta inmune inducida respecto a la producida en infecciones individuales. Similarmente, se observan efectos de inhibición de la inmunidad innata in vivo en larvas de G. mellonella coinfectadas, a nivel de producción de péptidos antimicrobianos, enzimas y proteínas antimicrobianas.

Finalmente, se estudia la capacidad de determinadas especies de micobacterias no tuberculosas, y particularmente de M. brumae, de modular el sistema inmune del huésped utilizando el modelo in vivo de larvas de G. mellonella, para protegerlo frente a la infección por diferentes microorganismos patógenos. Así se demuestra que la exposición a M. brumae, resulta eficaz en la contención de posteriores infecciones por bacterias letales para el insecto. Esta protección está mediada por cascadas de señalización activadas por M. brumae que inducen una elevada respuesta inmune innata del insecto.

Non-tuberculous mycobacteria are found in the environment, in soil or aquatic environments, where they grow without requiring a host, unlike obligate intracellular mycobacteria pathogens that cause diseases such as tuberculosis or leprosy. There are more than 150 described nontuberculous mycobacteria species, of which most are non-pathogenic, although some species are opportunistic pathogens. The incidence of infections due to non-tuberculous mycobacteria has increased continuously in recent years. Knowledge about non-tuberculous mycobacteria is limited compared with disease-causing mycobacteria, especially Mycobacterium tuberculosis.

The knowledge of the possible interaction of non-tuberculous mycobacteria with pathogenic microorganisms and the role of these mycobacteria in modulating the host's immune system could provide us tools to prevent infections or to use mycobacteria as immune system modulators. This thesis aims to characterize different aspects of innocuous and opportunistic pathogenic non-tuberculous mycobacteria to demonstrate their clinical and immunomodulatory importance.

An aspect poorly studied in non-tuberculous mycobacteria is the formation of intracellular lipid inclusions. In M. tuberculosis, these inclusions represent a source of energy for persistence in the host, entry into a latency state, or resistance to antibiotics. In this thesis, using electron microscopy techniques, the intracellular lipid inclusions developed by Mycobacterium brumae, a non-pathogenic environmental species with a known immunomodulatory effect, are described and characterized, demonstrating the development of lipid inclusions is not exclusive to pathogenic species containing a similar lipid composition to M. tuberculosis.

The genetic transformation of non-tuberculous mycobacteria with exogenous genetic material is minimal due to their cell wall’s thickness and complexity, making foreign DNA incorporation extremely difficult. Therefore, this thesis develops a procedure that improves electroporation efficiencies (transformation) in environmental mycobacteria by inhibiting restriction-modification systems, desalting transforming DNA, and effectively disintegrating mycobacterial aggregates.

Opportunistic infections caused by some non-tuberculous mycobacteria develop mainly in the respiratory tract and Mycobacterium abscessus is the most frequently isolated species and whose incidence is increasing dramatically in patients with chronic lung diseases, especially in patients suffering from cystic fibrosis. The presence of M. abscessus is accompanied by other pathogenic bacteria that co-infect the lungs, being Pseudomonas aeruginosa the most frequent pathogenic bacterium found in this context. Respiratory tract co-infection by M. abscessus and P. aeruginosa significantly increases the morbidity and mortality of patients due to its biofilm-forming capacity. This thesis develops a method for quantifying static biofilms using fluorescent and bioluminescent strains, demonstrating the coexistence and stability of both species in dual biofilms. By infecting bronchial epithelial cells in vitro, it is described that coinfection by M. abscessus and P. aeruginosa leads to a decreased induced immune response compared to that triggered by individual bacterial infections. Similarly, repressive effects on the innate immunity in vivo in co-infected G. mellonella larvae are observed and are related to the level of production of antimicrobial peptides, enzymes, and antimicrobial proteins.

Finally, the thesis studies the ability of certain species of non-tuberculous mycobacteria, and M. brumae particularly, to modulate the host's immune system using the in vivo model of G. mellonella larvae, to protect it against infection by different microbial pathogens. Our work demonstrates that exposure to M. brumae effectively contains subsequent insect infections by lethal bacteria. This protection is mediated by signaling cascades activated by M. brumae that induce a high innate immune response in the insect.