Epigenomic Dynamics Associated with Myeloid Cell Immune Response Remodeling

Abstract

[eng] Monocytes are highly plastic cells and possess the ability to differentiate into cell types with very different immunological properties. Depending on the external stimuli and the specific immune context, they can give rise to cells that promote immune responses or immune tolerance. These extracellular signals are recognized by specific receptors and integrated by signaling pathways which lead to the participation of transcription factors. Transcriptional remodeling promoted by these transcription factors is generally associated with epigenetic modifications such as histone modifications and DNA methylation. DNA methylation is crucial in the acquisition of immune cells' identity and function. In particular, DNA methylation changes in several human monocytes differentiation models have been previously described. In this thesis, the molecular mechanisms and epigenomic remodeling regulating the development of immunogenic or tolerogenic phenotypes of three clinically relevant monocyte-derived differentiation processes have been studied. Firstly, we investigated the transcriptomic and epigenomic remodeling associated with glucocorticoid-mediated monocyte differentiation to tolerogenic dendritic cells (tolDCs), a cell type that constitutes a potential treatment for various autoimmune diseases. We revealed a major role of MAFB in this process, in synergy with GR. Although both GR and MAFB interact with TET2 and can drive DNA demethylation, the role of MAFB is more extensive, binding to thousands of genomic loci in tolDCs. In this regard, we demonstrated that MAFB knockdown erases the tolerogenic properties of tolDCs and reverts the specific DNA demethylation and gene upregulation. Moreover, in vivo monocyte-derived

cells from synovium in rheumatoid arthritis patients treated with glucocorticoids presented an expansion of ‘tolDC-like’ cells with upregulation of MAFB and MAFB target genes. Secondly, we analyzed the effects of vitamin C treatment during monocyte to dendritic cell (DC) differentiation and their subsequent maturation. DNA demethylation has been previously reported to be crucial in that process. Vitamin C is a known cofactor of TET enzymes, which are involved in active demethylation. We outlined extensive vitamin C-mediated demethylation, together with concordant gene expression changes during DC maturation. p65 ( NF-κB) interacts with TET2 and is associated with gene upregulation and DNA demethylation produced by vitamin C treatment. Finally, vitamin C increases TNFβ production and T cell stimulation capabilities of DCs. Thirdly, we integrated the DNA methylation and gene expression remodeling following in vitro exposure of human monocytes to lipopolysaccharide (LPS), a process that generates endotoxin tolerance, a state of hyporesponsiveness to further immune stimuli. In addition, we described phosphorylation of STAT1, STAT3, and STAT5, factors of the JAK2 pathway, after LPS treatment of monocytes. We identified TET2- mediated demethylation and gene upregulation during the first encounter with LPS associated with the JAK2-STAT signaling pathway. In addition, we found that JAK2 inhibition accentuates the tolerant phenotype of monocytes and reduces the expression of tolerized genes. Finally, monocytes from gram-negative septic patients showed lower levels of STAT1 phosphorylation after a second LPS challenge, indicating a reduced JAK2 activity.

[cat] Els monòcits són cèl·lules plàstiques amb capacitat de diferenciació a tipus cel·lulars amb propietats immunològiques molt diferents. Depenent dels estímuls externs i del context immunològic, poden donar lloc a cèl·lules que promouen una resposta immunitària o tolerància. Aquests senyals extracelul·lars són reconeguts per receptors específics i integrats per vies de senyalització que condueixen a la participació de factors de transcripció. La remodelació transcripcional promoguda per aquests factors de transcripció s'associa generalment amb canvis epigenètics com a modificacions d'histones o la metilació del DNA. La metilació del DNA és crucial en l'adquisició de la identitat i la funció de les cèl·lules immunitàries. En particular, s'han descrit canvis en la metilació del DNA en diversos models de diferenciació de monòcits humans. En aquesta tesi, hem estudiat els mecanismes moleculars i la remodelació epigenòmica que regulen el desenvolupament de fenotips inmunogènics o tolerogènics de tres processos de diferenciació de monòcits clínicament rellevants. En primer lloc, hem investigat la remodelació transcriptòmica i epigenòmica associada a la diferenciació de monòcits a cèl·lules dendrítiques tolerogèniques (tolDC) amb glucocorticoides, un tipus cel·lular que constitueix un tractament potencial per a diverses malalties autoimmunes. MAFB té un paper fonamental en aquest procés, en sinergia amb GR. Encara que tant GR com MAFB interactuen amb TET2 i poden promoure la desmetilació del DNA, el paper de MAFB és més ampli, ja que s'uneix a milers de loci en el genoma de les tolDC. En aquest sentit, hem demostrat que l'eliminació de MAFB reverteix les propietats tolerogèniques de les tolDC, la desmetilació específica del

DNA i la regulació dels gens. A més, les cèl·lules derivades de monòcits in vivo obtingudes de membrana sinovial de pacients amb artritis reumatoide tractats amb glucocorticoides van presentar una expansió de cèl·lules similars a les tolDC amb una alta expressió tant de MAFB com dels seus gens diana. En segon lloc, hem analitzat els efectes del tractament amb vitamina C durant la diferenciació de monòcits a cèl·lules dendrítiques (DC) i la seua posterior maduració. La desmetilació del DNA ha sigut prèviament descrita com a crucial en aquest procés. La vitamina C és un cofactor conegut dels enzims TET, que participen en la desmetilació activa. En aquest sentit, hem descrit una àmplia desmetilació mediada per la vitamina C, juntament amb canvis concordants en l'expressió gènica durant la maduració de les DCs. p65 (NF-κB) interactua amb TET2 i s'associa amb la inducció de gens i la desmetilació del DNA produïda pel tractament amb vitamina C. Finalment, la vitamina C augmenta la producció de TNFβ i la capacitat d'estimulació de cèl·lules T de les DC. En tercer lloc, hem integrat la metilació del DNA i la remodelació de l'expressió gènica després de l'exposició in vitro de monòcits humans a lipopolisacàrid (LPS), un procés que genera un tipus de memòria immunitària innata denominat tolerància a endotoxines, el qual constitueix un estat hiporesponsiu a nous estímuls immunitaris. A més, hem descrit la fosforilació de STAT1, STAT3 i STAT5, elements associats amb JAK2, després del tractament dels monòcits amb LPS. Durant la primera exposició dels monòcits a LPS, hem trobat desmetilació mediada per TET2 i inducció de gens associats a JAK2-STAT. Addicionalment, hem descrit que la inhibició de JAK2 accentua la tolerància en els monòcits i redueix l'expressió dels gens toleritzats. Finalment, monòcits de pacients sèptics infectats amb bacteris gramnegatius van mostrar menors nivells de fosforilació de STAT1 després d'un segon tractament amb LPS, indicant que presenten una menor activitat de JAK2.

[spa] Los monocitos son células plásticas con capacidad de diferenciación a tipos celulares con propiedades inmunológicas muy diferentes. Dependiendo de los estímulos externos y del contexto inmunológico, pueden dar lugar a células que promuevan una respuesta inmunitaria o tolerancia. Estas señales extracelulares son reconocidas por receptores específicos e integradas por vías de señalización que conducen a la participación de factores de transcripción. La remodelación transcripcional promovida por estos factores de transcripción se asocia generalmente con cambios epigenéticos como modificaciones de histonas o la metilación del DNA. La metilación del DNA es crucial en la adquisición de la identidad y la función de las células inmunitarias. En particular, se han descrito cambios en la metilación del DNA en varios modelos de diferenciación de monocitos humanos. En esta tesis, hemos estudiado los mecanismos moleculares y la remodelación epigenómica que regulan el desarrollo de fenotipos inmunogénicos o tolerogénicos de tres procesos de diferenciación de monocitos clínicamente relevantes. En primer lugar, hemos investigado la remodelación transcriptómica y epigenómica asociada a la diferenciación de monocitos a células dendríticas tolerogénicas (tolDC) con glucocorticoides, un tipo celular que constituye un tratamiento potencial para varias enfermedades autoinmunes. MAFB tiene un papel fundamental en este proceso, en sinergia con GR. Aunque tanto GR como MAFB interactúan con TET2 y pueden promover la desmetilación del DNA, el papel de MAFB es más amplio, ya que se une a miles de loci en el genoma de las tolDC. En este sentido, hemos demostrado que la eliminación de MAFB borra las

propiedades tolerogénicas de las tolDC y revierte la desmetilación específica del DNA y la regulación de los genes. Además, las células derivadas de monocitos in vivo, obtenidas de membrana sinovial de pacientes con artritis reumatoide tratados con glucocorticoides presentaron una expansión de células similares a las tolDC con una alta expresión tanto de MAFB como de sus genes diana. En segundo lugar, hemos analizado los efectos del tratamiento con vitamina C durante la diferenciación de monocitos a células dendríticas (DC) y su posterior maduración. La desmetilación del DNA ha sido previamente descrita como crucial en ese proceso. La vitamina C es un cofactor conocido de las enzimas TET, que participan en la desmetilación activa. En este sentido, hemos descrito una amplia desmetilación mediada por la vitamina C, junto con cambios concordantes en la expresión génica durante la maduración de las DC. p65 (NF-κB) interactúa con TET2 y se asocia con la inducción de genes y la desmetilación del DNA producida por el tratamiento con vitamina C. Por último, la vitamina C aumenta la producción de TNFβ y la capacidad de estimulación de células T de las DC. En tercer lugar, hemos integrado la metilación del DNA y la remodelación de la expresión génica tras la exposición in vitro de monocitos humanos a lipopolisacárido (LPS), un proceso que genera un tipo de memoria immune innata denominado tolerancia a endotoxinas, el cual constituye un estado hiporesponsivo a nuevos estímulos inmunitarios. Además, hemos descrito la fosforilación de STAT1, STAT3 y STAT5, factores asociados con JAK2, tras el tratamiento de los monocitos con LPS. Durante la primera exposición de los monocitos a LPS, encontramos desmetilación mediada por TET2 e inducción de genes

asociados a JAK2-STAT. Adicionalmente, encontramos que la inhibición de JAK2 acentúa la tolerancia en los monocitos y reduce la expresión de los genes tolerizados. Por último, monocitos de pacientes sépticos gram- negativos mostraron menores niveles de fosforilación de STAT1 tras un segundo tratamiento con LPS, lo cual indica que presentan una menor actividad de JAK2.