Immunotherapy with memory “stem” Tcells modified with chimeric antigenspecific receptors (CARs) for patients with lymphoid neoplasms

Abstract

La teràpia cel·lular adoptiva amb cèl·lules T modificades amb un receptor quimèric antigen-específic (CAR) dirigit contra CD19 ha demostrat resultats excel·lents en les neoplàsies de cèl·lules B. No obstant això, la seva aplicació en altres neoplàsies hematològiques malignes que no tenen l’expressió de CD19, com el limfoma de Hodgkin clàssic (LHc), continua sent un desafiament clínic. La proteïna CD30 s’expressa en les cèl·lules de Hodgkin i Reed-Sternberg (HRS) i és absent a la majoria dels teixits sans, per la qual cosa constitueix una diana ideal per a la teràpia cel·lular adoptiva en aquesta malaltia. Tot i això, l’eficàcia de les cèl·lules T dirigides contra CD30 (CART30) per al tractament de l’LHc continua sent modesta, ja que més del 50 % dels pacients no responen. L’eficàcia de la teràpia CART30 es pot veure influenciada per diversos factors relacionats amb el producte infós, el bloqueig del CAR30 per la presència de proteïna CD30 soluble i la baixa persistència de cèl·lules CART30. Hem desenvolupat un nou CAR30 dirigit a un epítop proximal a la membrana, dins de la part no escindible de la proteïna CD30, amb l’objectiu de millorar l’eficàcia antitumoral de la teràpia CART30. A més, hem desenvolupat productes enriquits en cèl·lules T de memòria “stem” (cèl·lules TSCM-LIKE) per prolongar la persistència i augmentar l’activitat antitumoral. Hem generat les cèl·lules CAR30+ TSCM-LIKE, que van ser expandides ex vivo, malgrat l’expressió de CD30 a les cèl·lules T activades i la mort fratricida d’algunes aquestes cèl·lules T CD30+CAR30+. Les nostres cèl·lules CAR30+ TSCM-LIKE no es van veure afectades per la proteïna CD30 soluble i, més encara, van erradicar completament l’HL in vivo, i van evidenciar la seva gran persistència i la seva prolongada eficàcia antitumoral. A més, els productes CART30 altament enriquits en cèl·lules TSCM-LIKE han aconseguit un avantatge de supervivència in vivo comparats amb els productes compostos fonamentalment per cèl·lules CART30 més diferenciades. D’altra banda, hem plantejat la hipòtesi que la intensitat d’expressió del CAR tindria un impacte significatiu a l’eficàcia de la teràpia CART. Aquesta hipòtesi l’hem constatat amb els nostres productes CART30 enriquits amb TSCM-LIKE. Hem separat les cèl·lules CART30 segons la intensitat de fluorescència mitjana del CAR, en dues poblacions marcadament diferents (CAR30HI i CAR30LO), demostrem que una alta expressió de CAR millora l’eficàcia antitumoral ex vivo, que aquesta gran efectivitat es manté després de reexposicions seqüencials a cèl·lules tumorals diana i que no està associada a l’esgotament o diferenciació cel·lular. A més, trobem una correlació entre l’alta expressió de CAR a la superfície i l’efecte antitumoral amb les cèl·lules CART19, la qual cosa valida les nostres troballes amb les cèl·lules CART30. Finalment, l’eficàcia antitumoral superior de les cèl·lules CAR30HI es va demostrar en un model in vivo de LH, en què els productes CART30 enriquits amb TSCM-LIKE amb alta intensitat d’expressió de CAR, van aconseguir un control tumoral més gran i una supervivència més prolongada que aquells amb una baixa intensitat del CAR30. Les nostres dades posen en evidència l’òptima eficàcia antitumoral obtinguda amb el nou CAR30 dirigit contra un epítop inclòs a la part no escindible de la proteïna CD30 i utilitzat en productes altament enriquits en cèl·lules TSCM-LIKE. A més, hem mostrat que la intensitat de l’expressió de CAR a la superfície cel·lular influeix en l’eficàcia antitumoral, cosa que suggereix que la modulació de la intensitat de l’expressió de CAR s’ha de considerar un dels factors útils per millorar l’eficàcia de les cèl·lules CART anti-CD30.

La terapia celular adoptiva con células T modificadas con un receptor quimérico antígeno–específico (CAR) dirigido contra CD19 ha demostrado resultados sobresalientes en las neoplasias de células B. Sin embargo, su aplicación en otras neoplasias hematológicas malignas que carecen de la expresión de CD19, como el linfoma de Hodgkin clásico (LHc), sigue siendo un desafío clínico. La proteína CD30 se expresa en las células de Hodgkin y Reed-Sternberg (HRS) y está ausente en la mayoría de los tejidos sanos, por lo que constituye una diana ideal para la terapia celular adoptiva en esta enfermedad. Sin embargo, la eficacia de las células T dirigidas contra CD30 (CART30) para el tratamiento del LHc sigue siendo modesta, ya que más del 50 % de los pacientes no responden. La eficacia de la terapia CART30 puede verse influenciada por varios factores relacionados con el producto infundido, el bloqueo del CAR30 por la presencia de proteína CD30 soluble y la baja persistencia de células CART30. Hemos desarrollado un nuevo CAR30 dirigido a un epítopo proximal a la membrana, dentro de la parte no escindible de la proteína CD30, con el objetivo de mejorar la eficacia antitumoral de la terapia CART30. Además, hemos desarrollado productos enriquecidos en células T de memoria “stem” (células TSCM-LIKE) para prolongar la persistencia y aumentar la actividad antitumoral. Hemos generado las células CAR30+ TSCM-LIKE, que fueron expandidas ex vivo, a pesar de la expresión de CD30 en las células T activadas y la muerte fratricida de algunas estas células T CD30+CAR30+. Nuestras células CAR30+ TSCM-LIKE no se vieron afectadas por la proteína CD30 soluble y, más aún, erradicaron por completo el HL in vivo, evidenciando su gran persistencia y su prolongada eficacia antitumoral. Además, los productos CART30 altamente enriquecidos en células TSCM-LIKE han logrado una ventaja de supervivencia in vivo comparados con los productos compuestos fundamentalmente por células CART30 más diferenciadas. Por otra parte, hemos planteado la hipótesis de que la intensidad de expresión del CAR tendría un impacto significativo en la eficacia de la terapia CART. Esta hipótesis la hemos comprobado con nuestros productos CART30 enriquecidos con TSCM-LIKE. Hemos separado las células CART30 según la intensidad de fluorescencia media del CAR, en dos poblaciones marcadamente diferentes (CAR30HI y CAR30LO), demostramos que una alta expresión de CAR mejora la eficacia antitumoral ex vivo, que esa gran efectividad se mantiene después de reexposiciones secuenciales a células tumorales diana y que no está asociada al agotamiento o diferenciación celular. Además, encontramos una correlación entre la alta expresión de CAR en la superficie y el efecto antitumoral con las células CART19, lo cual valida nuestros hallazgos con las células CART30. Por último, la eficacia antitumoral superior de las células CAR30HI se demostró en un modelo in vivo de LH, en el que los productos CART30 enriquecidos con TSCM-LIKE con alta intensidad de expresión de CAR, lograron un mayor control tumoral y una supervivencia más prolongada que aquellos con una baja intensidad del CAR30. Nuestros datos ponen en evidencia la óptima eficacia antitumoral obtenida con el nuevo CAR30 dirigido contra un epítopo incluido en la parte no escindible de la proteína CD30 y utilizado en productos altamente enriquecidos en células TSCM-LIKE. Además, hemos mostrado que la intensidad de la expresión de CAR en la superficie celular influye en la eficacia antitumoral, lo que sugiere que la modulación de la intensidad de la expresión de CAR debe considerarse uno de los factores útiles para mejorar la eficacia de las células CART anti-CD30.

Adoptive cell therapy (ACT) with T-cells modified with a chimeric antigen receptor (CAR) directed against CD19 has demonstrated outstanding results in B-cell lymphoma. However, its application in other hematologic malignancies that lack of CD19 expression, such as classical Hodgkin lymphoma (cHL) remains a clinical challenge. The CD30 protein is expressed in Hodgkin and Reed–Sternberg cells and is absent from most healthy tissues, representing an ideal target for ACT in this disease. Nevertheless, efficacy of CAR30 T-cells for cHL remains modest, with more than 50% of patients being unresponsive. CART30 therapy efficacy may be influenced by several factors related to the infused product, the blockade of CAR30 by the soluble CD30 protein and low persistence of CAR30+ T-cells. Here, we have developed a novel CAR30 targeting a membrane-proximal epitope within the non-cleavable part of CD30 protein to improve antitumor efficacy of CART30 therapy. Furthermore, we developed products enriched for memory “stem” T-cells (TSCM-LIKE cells) to improve engraftment, prolong persistence, and enhance antitumor activity. CAR30+ TSCMLIKE cells were successfully generated and expanded ex vivo, despite CD30 expression and fratricide killing of CD30+CAR30+T-cells. Our CAR30+ TSCM-LIKE cells were not impaired by soluble CD30 and completely eradicated HL in vivo, with high persistence and longlasting immunity. In addition, CAR30 T-cell products highly enriched for TSCM-LIKE cells have shown a survival advantage in contrast to more differentiated CAR30 T-cells. Moreover, we have hypothesized that CAR expression level would have a significant impact on CART efficacy and tested this with CAR30+ TSCM-LIKE enriched cells. By sorting T-cells according to CAR mean fluorescence intensity in two markedly different populations (CAR30HI and CAR30LO), we showed that a high CAR expression enhances antitumor efficacy ex vivo, that is sustained after sequential re-exposures to tumor cells and is not associated to T-cell exhaustion or differentiation. Furthermore, we found a correlation between high surface CAR expression and antitumor effect with CAR19+ T-cells, thus validating our findings with CAR30. Definitive proof of CAR30HI T-cells improved antitumor efficacy was demonstrated in a human HL xenograft mouse model, where CAR30-TSCM-LIKE enriched products with high intensity of CAR expression achieved superior tumor control in vivo and longer survival than those with a low intensity of CAR expression. Our data highlights the superior efficacy of novel CAR30 directed against an epitope within the non-cleavable part of CD30 protein with highly enriched TSCM-LIKE products. Furthermore, our data shows that intensity of CAR expression on cell surface influences antitumor efficacy, suggesting that modulation of CAR expression intensity should be considered as a critical factor to improve efficacy of anti-CD30 CAR T-cells.