Novel multifunctional biomimetic peptides for bone tissue engineering

Abstract

(English) Mimicking bone extracellular matrix (ECM) is essential to improve cell-material interactions. In this regard, the functionalization of materials with biomolecules derived from the bone ECM is a promising approach. In particular, the use of integrin binding molecules in combination with growth factors (GFs)-derived peptides involved in the bone regeneration process, i.e., BMP-2-derived peptides, can be employed to install bioactivity in biomaterials and reproduce the bone ECM microenvironment. Based on these evidences, the present PhD Thesis focuses on the development of a multifunctional biomimetic peptide integrating the well-known RGD motif and the osteogenic DWIVA sequence derived from the wrist epitope of BMP-2 in a spatially controlled manner, and its use to functionalize different types of biomaterials. This molecule, identified as the RGD-DWIVA biomimetic peptide, is the central core of this PhD Thesis. In Chapter I, functionalization of glass model substrates with the engineered biomimetic peptide is performed. The biological behavior as well as the capacity to synergistically promote integrin/GF signaling of such biomimetic interfaces are then evaluated with C2C12 myoblasts. The results demonstrate the potential of RGD-DWIVA to enhance C2C12 cell adhesion, their transdifferentiation towards the osteogenic lineage and the activation of Smad-independent signaling pathways. Next, with the purpose of finding new BMP-2-derived sequences with osteogenic potential, a small library of synthetic peptides is reported. The osteogenic capacity of these peptides then is screened using the C2C12 cellular model. To our surprise, peptides with better biological properties than DWIVA are not identified, and, therefore, the RGD-DWIVA peptide is continued to be used and evaluated with human mesenchymal stem cells (MSCs), showing an improvement in cell adhesion and osteogenic differentiation. On the basis of the successful results with MSCs, the PhD Thesis further explores in Chapter II the application of the biomimetic peptide to more clinically relevant biomaterials, i.e., titanium. The extraordinary affinity of the anchoring unit of the peptides to metallic oxides is demonstrated by different physicochemical methods. In addition, the biological effects associated to the cyclization of either one (cRGD-DWIVA) of both bioactive motifs (cRGD-cDWIVA) in comparison to the RGD-DWIVA is also studied. To go a step further, the resulting biomimetic peptides are used to functionalize titanium implants, which are implanted in a rat calvarial deffect. Subsequently, the capacity of the engineered peptides to promote new bone formation and reduce fibrous tissue in vivo is assessed. Chapter III focuses on the translation of the previous strategy from 2D to 3D microenvironments. In this regard, two different hydrogels are studied: alginate and polyethylene glycol (PEG). As preliminary studies, functionalization of both hydrogels with an RGD-model peptide is performed. The rationale behind this approach is to compare the properties of the hydrogels, i.e., composition or mechanical properties, among others. As a result of this study, novel biodegradable PEG hydrogels are selected and further modified with the cRGD-DWIVA and cRGD-cDWIVA biomimetic peptides. A comprehensive physicochemical characterization of the hydrogels is performed, followed by the evaluation of their biological potential, demonstrating their capacity to trigger cell spreading and osteogenic differentiation of MSCs. In summary, using our multifunctional biomimetic peptides we were able to mimic the bone ECM (both in 2D and 3D) without the use of GFs, which may pave the way for alternative GF-based treatments in bone tissue engineering.

(Català) La recreació de la matriu extracel·lular òssia (ECM) és una estratègia essencial per millorar la interacció material-cèl·lula. En aquest sentit, la funcionalització de materials amb biomolècules derivades de la matriu extracel·lular òssia (ECM) és una estratègia prometedora. En particular, la combinació de molècules d'unió d’integrines juntament amb pèptides derivats de factors de creixement (GFs) implicats en el procés de regeneració òssia, és a dir, pèptides derivats de la proteïna morfogenètica òssia 2 (BMP-2), es pot emprar per instal·lar bioactivitat en biomaterials i reproduir el microambient de la ECM òssia. Basant-nos en aquestes evidències, aquesta tesi doctoral es centra en el desenvolupament d'un pèptid biomimètic multifuncional que integra el conegut motiu RGD i la seqüència DWIVA osteogènica, derivada de l'epítop wrist de la BMP-2, d'una manera controlada espacialment. Aquesta molècula, identificada com el pèptid biomimètic RGD-DWIVA, és utilitzada per funcionalitzar diferents tipus de biomaterials i és el nucli central d'aquesta tesi doctoral. Al capítol I, es realitza la funcionalització de substrats model de vidre amb el pèptid biomimètic. El comportament biològic, així com la capacitat per promoure sinèrgicament la senyalització integrina/GF d'aquestes superfícies biomimètiques s'avalua amb mioblasts C2C12. Els resultats demostren el potencial de l’RGD-DWIVA per millorar l'adhesió de les cèl·lules C2C12, la seua transdiferenciació cap al llinatge osteogènic i l'activació de les vies de senyalització independent de Smad. A continuació, amb el propòsit de trobar noves seqüències derivades de la BMP-2 amb potencial osteogènic, es crea una xicoteta biblioteca de pèptids sintètics. La capacitat osteogènica d’aquestos pèptids s’estudia utilitzant també cèl·lules C2C12. Per a la nostra sorpresa, no s'identifiquen pèptids amb millors propietats biològiques que el DWIVA, i, per tant, el pèptid RGD-DWIVA es continua utilitzant i avaluant amb cèl·lules mare mesenquimals humanes (MSCs), mostrant una millora tant en l'adhesió cel·lular com en la diferenciació osteogènica. A partir dels resultant tan existoso amb les MSC, la tesi doctoral explora, al Capítol II, l'aplicació del pèptid biomimètic en biomaterials més rellevants clínicament, com el titani. L'afinitat extraordinària de la unitat d'ancoratge dels pèptids als òxids metàl·lics es demostra per diferents mètodes fisicoquímics. A més, també s’estudien els efectes biològics associats a la ciclació d’un (cRGD-DWIVA) o ambdós motius bioactius (cRGD-cDWIVA) en comparació a l’RGD-DWIVA. A més, aquestos tres pèptids biomimètics s'utilitzen per funcionalitzar implants de titani, que s'implanten en un defecte de calvària de rata, i es demostra la capacitat dels pèptids multifuncionals per promoure la formació de nou os i reduir el teixit fibrós in vivo. El Capítol III es centra en la translació de l'estratègia anterior (en ambients 2D) a microambients 3D. En aquest sentit, s'estudien dos hidrogels diferents; l’alginat i el polietilè glicol (PEG). Com a estudis preliminars, es realitza la funcionalització dels dos hidrogels amb un pèptid model RGD. D’aquesta manera es pretén comparar les propietats d’ambdós hidrogels, com la composició o les propietats mecàniques, entre altres. Com a resultat d'aquest estudi, es seleccionen els hidrogels biodegradables de PEG i es modifiquen amb els pèptids biomimètics cRGD-DWIVA i cRGD-cDWIVA. Es realitza una caracterització fisicoquímica dels hidrogels, seguida d’una avaluació del seu potencial biològic, demostrant la seua capacitat per desencadenar l’estirament de les MSCs i la seua diferenciació osteogènica. En resum, utilitzant els nostres pèptids biomimètics multifuncionals, hem pogut imitar la matriu extracel·lular òssia (tant en 2D com en 3D) sense utilitzar GFs, el que pot proporcionar potencials tractaments alternatius als GFs en l’enginyeria de teixits de l’os.