Role of two pathogenesis-related proteins (PRs) in tomato plant defense against Ralstonia solanacearum

Abstract

El patogen vegetal Ralstonia solanacearum és l'agent causal de la devastadora malaltia coneguda com a marciment bacterià. R. solanacearum és un patogen del sòl i vascular que ingressa a les plantes hostes a través de ferides a les arrels i llocs d'emergència de les arrels laterals. Un cop dins de la planta, el patogen travessa l'apoplast cortical fins arribar al cilindre vascular i es multiplica ràpidament als vasos del xilema, assolint nombres molt alts. La combinació del creixement bacterià i la secreció d'un exopolisacàrid viscós obstrueix els vasos infectats, bloquejant el flux d'aigua i causant símptomes de marciment que condueixen a la mort de la planta. Fins a la data, el mètode més efectiu per controlar R. solanacearum és l'ús de resistència genètica.

A l'apoplast, el primer camp de batalla entre la planta i el patogen, l'hoste pot percebre els patrons moleculars associats a microbis (MAMP, per les seves sigles en anglès) a través dels receptors, activant la immunitat desencadenada per patrons (PTI, per les seves sigles en anglès). Com a part de la seva resposta de defensa, les cèl·lules vegetals secreten proteases que poden tallar les proteïnes del patogen fent-les detectables pel sistema immune. Les proteases vegetals secretes també poden desencadenar la immunitat proteolitzant altres proteïnes vegetals. No obstant això, els patògens poden contrarestar la proteòlisi utilitzant inhibidors de proteases. Alhora, les plantes hostes poden secretar quitinasa i peroxidases per combatre els patògens a l'apoplast. Per explorar les respostes proteòmiques en resposta a R. solanacearum en plantes de tomàquet, vam extreure apoplast i xilema de cultivars susceptibles (Marmande) i resistents (H7996) després de la infecció. La proteòmica comparativa va revelar una alta inducció de la proteasa P69s (Capítol I) i les proteïnes PR1 (Capítol II) durant la infecció per R. solanacearum.

Al Capítol I, vam caracteritzar el paper de la família de subtilases P69 específiques de les Solanàcies en la interacció entre R. solanacearum i les plantes de tomàquet. La infecció per R. solanacearum va activar post-traduccionalment diverses P69s de tomàquet. Entre elles, P69D es va activar exclusivament a les plantes de tomàquet resistents H7996. Experiments in vitro van mostrar que l'activació de P69D per l'eliminació del prodomini es va produir de manera autocatalítica e intramolecular, en una reacció no dependent del residu aigües amunt del lloc de processament. És important assenyalar que les plantes de tomàquet deficients en P69D eren més susceptibles al marciment bacterià. L'expressió transitòria de P69B, D i G a Nicotiana benthamiana va limitar la proliferació de R. solanacearum.

Al Capítol II, vam caracteritzar el paper de la família de proteïnes PR1 en la interacció entre el tomàquet i R. solanacearum. La infecció de les plantes de tomàquet va donar lloc a l'acumulació de quatre proteïnes PR1 diferents PR1a, b, c i d. Les proteïnes PR1s es localitzaven en cossos multivesiculars. La mutació del lloc de tall va atrapar PR1b en el reticle endoplasmàtic (ER), però no a PR1c, que encara podia translocar-se als cossos multivesiculars. PR1b i les seves variants no mostren una funció antimicrobiana directa contra R. solanacearum. No obstant això, un péptid CAPE sintetitzat químicament, derivat de PR1b, va inhibir la multiplicació de R. solanacearum en fulles i xilema de tomàquet mitjançant l'activació de gens de defensa de la planta, com gens sensibles a l'àcid jasmònic (PI-I i PI-II) i PR1b, el seu propi precursor. És important destacar que dues de les tres línies mutants de tomàquet pr1b generades en aquest estudi eren lleugerament més resistents a la infecció per R. solanacearum, específicament quan el patogen va ser inoculat al sòl.

El patógeno vegetal Ralstonia solanacearum es el agente causal de la devastadora enfermedad conocida como marchitez bacteriana. R. solanacearum es un patógeno del suelo y vascular que ingresa en las plantas huésped a través de heridas en las raíces y sitios de emergencia de las raíces laterales. Una vez dentro de la planta, el patógeno atraviesa el apoplasto cortical hasta llegar al cilindro vascular y se multiplica rápidamente en los vasos del xilema, alcanzando números muy altos. La combinación del crecimiento bacteriano y la secreción de un exopolisacárido viscoso obstruye los vasos infectados, bloqueando el flujo de agua y causando síntomas de marchitez que conducen a la muerte de la planta. Hasta la fecha, el método más efectivo para controlar R. solanacearum es el uso de resistencia genética.

En el apoplasto, el primer campo de batalla entre la planta y el patógeno, el huésped puede percibir los patrones moleculares asociados a microbio (MAMP, por sus siglas en ingles) a través de los receptores, activando la inmunidad desencadenada por patrones (PTI, por sus siglas en inglés). Como parte de su respuesta de defensa, las células vegetales secretan proteasas que pueden cortar las proteínas del patógeno haciéndolas detectables por el sistema inmune. Las proteasas vegetales secretadas también pueden desencadenar la inmunidad proteolizando otras proteínas vegetales. Sin embargo, los patógenos pueden contrarrestar la proteólisis utilizando inhibidores de proteasas. A su vez, las plantas huésped pueden secretar quitinasa y peroxidasas para combatir a los patógenos en el apoplasto. Para explorar las respuestas proteómicas en respuesta a R. solanacerum en plantas de tomate, extrajimos apoplasto y xilema de cultivares susceptibles (Marmande) y resistentes (H7996) después de la infección. La proteómica comparativa reveló una alta inducción de la proteasa P69s (Capítulo I) y las proteínas PR1 (Capítulo II) durante la infección por R. solanacearum.

En el Capítulo I, caracterizamos el papel de la familia de subtilasas P69 específicas de las Solanáceas en la interacción entre R. solanacearum y el tomate. La infección por R. solanacearum activó post-traduccionalmente varias P69s de tomate. Entre ellas, P69D se activó exclusivamente en las plantas de tomate resistentes H7996. Experimentos in vitro mostraron que la activación de P69D por la eliminación del prodominio tuvo lugar autocatalítica- e intramolecularmente, en una reacción no dependiente del residuo aguas arriba del sitio de procesamiento. Es importante señalar que las plantas de tomate deficientes en P69D fueron más susceptibles a la marchitez bacteriana. La expresión transitoria de P69B, D y G en Nicotiana benthamiana limitó la proliferación de R. solanacearum. Nuestro estudio demuestra que las P69s tienen características conservadas pero funciones diversas en plantas de tomate y que P69D está involucrada en la resistencia a R. solanacearum pero no a otros patógenos vasculares como Fusarium oxysporum.

En el Capítulo II, caracterizamos el papel de la familia de proteínas PR1 en la interacción entre el tomate y R. solanacearum. La infección de plantas de tomate resultó en la acumulación de cuatro proteínas PR1 diferentes PR1a, b, c y d. Las proteínas PR1s se localizaron en cuerpos multivesiculares. La mutación del sitio de corte atrapó a PR1b en el retículo endoplásmico (ER), pero no a PR1c, que aún podía translocarse a los cuerpos multivesiculares. PR1b y sus variantes no tenían una función antimicrobiana directa contra R. solanacearum. Sin embargo, un péptido CAPE sintetizado químicamente, derivado de PR1b, inhibió la multiplicación de R. solanacearum en hojas y xilema de tomate mediante la activación de genes de defensa de la planta, como genes sensibles al ácido jasmónico (PI-I y PI-II) y PR1b, su propio precursor.

The plant pathogen Ralstonia solanacearum is the causal agent of the devastating disease known as bacterial wilt. R. solanacearum is a soil-borne and vascular pathogen that enters host plants through root wounds and lateral root emerging sites. Within the plant, the pathogen traverses the cortical apoplast until it reaches the vascular cylinder and proliferates rapidly the xylem vessels, reaching very high numbers. The combination of bacterial growth and the secretion of a mucus-like exopolysaccharide, clogs the infected vessels, blocking water flow and causing wilt disease symptoms that lead to the death of the plant. To date, the most effective method to control R. solanacearum is the use of genetic resistance. In the apoplast, the initial battlefield between plant and pathogen, the host can perceive microbe-associated molecular patterns (MAMP) through receptors, activating pattern-triggered immunity (PTI). As part of their defense response, plant cells secrete proteases that can cleave pathogen proteins to make them detectable by the immune system. Secreted plant proteases can also trigger immunity by proteolyzing other plant proteins. However, pathogens can counteract proteolysis using protease inhibitors. In turn, plant hosts can deploy chitinase and peroxidases to combat pathogens. To explore proteomic responses in response to R. solanacerum in tomato plants, we extracted apoplast and xylem from susceptible (Marmande) and resistant (H7996) cultivars after infection. Comparative proteomics revealed high induction of the protease P69s (Chapter I) and PR1 proteins (Chapter II) during R. solanacearum infection. In chapter I, we characterized the role of the Solanaceae-specific P69 subtilase family in the interaction between R. solanacearum and tomato. R. solanacearum infection post-translationally activated several tomato P69s. Among them, P69D was exclusively activated in resistant H7996 tomato plants. In vitro experiments showed that P69D activation by prodomain removal occurred in an autocatalytic and intramolecular reaction that does not rely on the residue upstream of the processing site. Importantly P69D-deficient tomato plants were more susceptible to bacterial wilt. Transient expression of P69B, D and G in Nicotiana benthamiana limited proliferation of R. solanacearum. Our study demonstrates that P69s have conserved features but diverse functions in tomato and that P69D is involved in resistance to R. solanacearum but not to other vascular pathogens like Fusarium oxysporum. In chapter II, we characterised the role of the PR1 protein family in the interaction between tomato and R. solanacearum. Infection of tomato plants resulted in the accumulation of four different PR1 proteins PR1a, b, c and d. PR1s localized in multivesicular bodies. Mutation of the cleavage site trapped PR1b in the endoplasmic reticulum (ER), but not PR1c, that still could translocate into multivesicular bodies. PR1b and its variants did not have a direct antimicrobial function against R. solanacearum. However, a chemically synthesized CAPE peptide, derived from PR1b, inhibited multiplication of R. solanacearum in tomato leaves and xylem through priming plant defense genes, such as jasmonic acid-responsive genes (PI-I and PI-II), and PR1b, its own precursor. Although the proteomics and N-terminomics in the chapter I indicated that PR1b could be a candidate substrate of P69D, we observed that the four PR1s tested were not cleaved by P69D in vitro. Importantly, two of the three tomato pr1b mutant lines generated in this study were slightly more resistant to R. solanacearum infection specifically when the pathogen was soil-inoculated.