Estudio in silico, in vitro y ex vivo de la actividad antitumoral de diferentes cepas de Mycobacterium Brumae y su papel en la activación y modulación del sistema inmune

Abstract

Les instil·lacions intravesicals del Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) és el tractament d'elecció en pacients de càncer de bufeta no múscul-invasiu (CBNMI) després de la resecció del tumor. El M. bovis BCG presenta una demostrada eficàcia en disminuir la recurrència i la progressió tumoral gràcies a l'activació del sistema immune del pacient, fet que millora la taxa de supervivència dels pacients de CBNMI. No obstant, el tractament intravesical amb aquest agent immunoterapeutic s'associa a efectes adversos en més del 50% dels pacients tractats, que poden desenvolupar complicacions greus fins en un 5% de casos, incloent infeccions pulmonars o disseminades. A més, fins a un 30-40% dels pacients no responen favorablement a la teràpia amb el M. bovis BCG, pel que es veuen obligats a interrompre el tractament. Una de les alternatives proposades per a substituir el tractament amb el M. bovis BCG és l'ús del Mycobacterium brumae, un micobacteri ambiental no patogen amb un efecte antitumoral i immunomodulador demostrat tant in vitro, com ex vivo i in vivo en un model murí de càncer vesical. Amb l'objectiu de desenvolupar noves alternatives terapèutiques que siguin eficaces per a tots els pacients de CBNMI, l' objectiu d' aquesta tesi és aprofundir en les característiques fenotípiques i genotípiques de diferents soques del M. brumae i comparar-les amb el M. bovis BCG; avaluar la seva interacció amb diversos tipus de cèl·lules tumorals; estudiar l'efecte immunomodulador d'ambdós micobacteris en el context específic de persones grans; i caracteritzar-ne la potencial capacitat d' induir immunitat entrenada. Inicialment, es va seqüenciar i analitzar el genoma de la soca de referència del M. brumae i de tres aïllats ambientals del M. brumae. La comparació amb el genoma del M. bovis i del M. tuberculosis va demostrar la no patogenicitat del M. brumae, així com la presència de gens involucrats en l'activació del sistema immune de l'hoste demostrant la seva immunogenicitat. No es van observar diferències a nivell fenotípic entre les diferents soques del M. brumae i molt poques a nivell genotípic. No obstant això, es va observar que la soca CR-103 era capaç d'inhibir la proliferació tumoral d'una manera més eficaç en algunes línies tumorals i que la soca CR-142 induïa una major producció de citocines en macròfags infectats, comparades amb la resta de soques. A més, es va demostrar la capacitat d'inhibir la proliferació tumoral del M. brumae a línies tumorals de localitzacions diferents a la bufeta, com a còlon, fetge o pàncrees. D' altra banda, es va estudiar la capacitat d'activar el sistema immune per part del M. brumae i del M. bovis BCG en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) de poblacions sanes joves i grans, així com de pacients amb neoplàsia vesical, observant-se diferències significatives entre les poblacions avaluades en quant a l'inducció de la producció de citocines pro-inflamatòries i la capacitat antitumoral de les PBMC estimulades. Finalment, es va avaluar si el M. brumae era capaç d' induir immunitat entrenada de la mateixa manera que el M. bovis BCG en diferents sistemes de cultius in vitro i ex vivo, utilitzant un model amb monòcits humans THP-1 i monòcits derivats de PBMCs, respectivament. Els resultats van indicar que l'estimulació inicial dels monòcits amb el M. brumae era capaç d' induir un increment a la producció de IL-6, TNF-[Alfa] i IL-1[Beta], així com un increment en la producció de lactat després d'un estímul secundari inespecífic, indicant un canvi al perfil metabòlic de les cèl·lules i revelant el potencial del M. brumae per induir immunitat entrenada.

La instilación por vía intravesical de Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) es el tratamiento de elección en pacientes con cáncer de vejiga no músculo-invasivo (CVNMI) tras la resección del tumor. M. bovis BCG presenta una eficacia demostrada disminuyendo la recurrencia y la progresión tumoral gracias a la activación del sistema inmune del paciente, lo cual mejora la tasa de supervivencia de los individuos con CVNMI. Sin embargo, el tratamiento intravesical con este agente inmunoterapéutico se asocia a efectos adversos en más del 50% de los pacientes tratados, pudiendo desarrollar complicaciones graves en un 5% de casos, incluyendo infecciones pulmonares o diseminadas. Además, hasta un 30-40% de los pacientes no responden favorablemente a la terapia con M. bovis BCG, por lo que se ven obligados a interrumpir el tratamiento. Una de las alternativas propuestas para sustituir el tratamiento con M. bovis BCG es el uso de Mycobacterium brumae, una micobacteria ambiental no patógena con un efecto antitumoral e inmunomodulador demostrado tanto in vitro, como ex vivo e in vivo en modelo murino de cáncer vesical. Con el objetivo de desarrollar nuevas alternativas terapéuticas que sean eficaces para todos los pacientes, el objetivo de esta tesis es profundizar en las características fenotípicas y genotípicas de diferentes cepas de M. brumae y compararlas con M. bovis BCG; evaluar su interacción con diversos tipos de células tumorales; estudiar el efecto inmunomodulador de ambas micobacterias en el contexto específico de personas mayores; y caracterizar su potencial capacidad de inducir inmunidad entrenada. Inicialmente se secuenció y analizó el genoma de la cepa de referencia de M. brumae y de tres aislados ambientales de M. brumae. La comparación con el genoma de M. bovis y M. tuberculosis demostró la no patogenicidad de M. brumae, así como la presencia de genes involucrados en la activación del sistema inmune del huésped demostrando su inmunogenicidad. No se observaron diferencias a nivel fenotípico de las diferentes cepas de M. brumae y muy pocas a nivel genotípico. Sin embargo, se observó que la cepa CR-103 era capaz de inhibir la proliferación tumoral de una forma más eficaz en algunas líneas tumorales y que la cepa CR-142 inducía una mayor producción de citocinas en macrófagos infectados, comparando con el resto de las cepas de M. brumae. Se demostró la capacidad de inhibir la proliferación tumoral de M. brumae en líneas tumorales de localizaciones diferentes a vejiga, como colon, hígado o páncreas. Por otro lado, se estudió la capacidad de activar el sistema inmune por parte de M. brumae y M. bovis BCG en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos sanos jóvenes y mayores, así como de pacientes con neoplasia vesical, obteniendo una diferencia significativa entre las poblaciones evaluadas en cuando a la inducción de la producción de citocinas proinflamatorias y la capacidad antitumoral de las PBMC estimuladas. Finalmente, se evaluó si M. brumae era capaz de inducir inmunidad entrenada como M. bovis BCG en diferentes cultivos in vitro y ex vivo, utilizando un modelo in vitro con monocitos humanos THP-1 y monocitos derivados de PBMC, respectivamente. Los resultados indicaron que la estimulación inicial de monocitos con M. brumae era capaz de inducir un incremento en la producción de IL-6, TNF-[Alfa] e IL-1[Beta], así como un incremento en la producción de lactato tras un estímulo secundario inespecífico, indicando un cambio en el perfil metabólico y revelando el potencial de M. brumae para inducir inmunidad entrenada.

Intravesical instillations of Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) is the preferred treatment in patients with non-muscle-invasive bladder cancer (NMIBC) after tumour resection. M. bovis BCG has demonstrated efficacy in reducing the recurrence and tumor progression due to the activation of the patient immune system, which enhances the survival rate of individuals with NMIBC. However, intravesical treatment with this immunotherapeutic agent is associated with adverse events in more than 50% of treated patients, being able to develop serious complications in 5% of cases, including lung or disseminated M. bovis BCG infections. Furthermore, up to 30-40% of patients do not respond to M. bovis BCG therapy and, consequently, they have to finish the treatment. One of the alternatives proposed to replace the M. bovis BCG treatment is the use of Mycobacterium brumae, an environmental non-pathogenic mycobacterium with an antitumor and immunomodulatory effect demonstrated in vitro, ex vivo and in vivo in a murine model of bladder cancer. With the aim of developing new therapeutic alternatives that are effective for all patients, the objective of this thesis is to decipher into the phenotypic characteristics and genotypes of different strains of M. brumae and compare them with M. bovis BCG; to evaluate their interaction with different tumour cells; to study the immunemodulatory effect of both mycobacteria in the specific context of older people; and to characterize its potential ability to induce trained immunity. Initially, the genome of the reference strain and three environmental isolates of M. brumae were sequenced and analysed. The comparison with the genome of M. bovis BCG and M. tuberculosis demonstrated the non-pathogenicity of M. brumae, as well as the presence of genes involved in the activation of the host immune system demonstrating its immunogenicity. No differences were observed at the phenotypic level of the different strains of M. brumae and very few at the genotypic level. However, it was observed that the CR-103 strain could inhibit some tumour cell proliferation more efficiently. Besides, the CR-142 strain induced an increase in cytokine production in infected macrophages, compared with the rest of the strains. The ability of M. brumae to inhibit the tumour proliferation was demonstrated in tumour cell lines from locations other than the bladder, such as colon, liver, or pancreas. On the other hand, the ability of M. brumae and M. bovis BCG to activate the immune system from young and old healthy populations, as well as from patients with bladder neoplasia was evaluated. Using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) a significant difference between the evaluated populations in terms of triggering the production of proinflammatory cytokines and the antitumor capacity of the activated PBMCs. Finally, the capacity of M. brumae to induce trained immunity, compared to M. bovis BCG, was evaluated in different in vitro and ex vivo cultures using an in vitro model with THP-1 human monocytes and PBMC-derived monocytes, respectively. The results indicated that the initial stimulation of monocytes with M. brumae followed by a secondary non-specific stimulus induce an elevated production of IL-1[Beta], IL-6, and TNF-[Alfa], and an enhanced lactate production. This indicates a change in the metabolic profile of the cells and shows the potential of M. brumae to induce trained immunity.