Regulation of CK2 by phosphoinositides and inositol pyrophosphates: implications in endocytosis

Abstract

[ENG] CK2 is a constitutively active serine/threonine kinase that consists in a tetramer composed by two catalytic and two regulatory subunits (termed Cka1, Cka2, Ckb1 and Ckb2 in yeast, respectively). Catalytic subunits drive the enzyme activity independently of regulatory subunits, which stabilize the tetramer and serve as a docking platform for the majority of targets. CK2 is vital for cell viability, involved in processes like cell growth, apoptosis or stress responses, yet its dysregulation is associated with diseases, particularly cancer. Increase activity and expression of catalytic subunits along with a downregulation in regulatory ones has been described to promote tumor progression. However, little is known about the regulation of the two CK2 isoforms (tCK2 and mCK2) and the biological consequences of its alteration. Previous research indicates that binding to the phosphoinositide PI(4,5)P2 leads to tCK2 disassembly and inactivation. During the thesis we delve into the mechanism by which PI(4,5)P2 (or other phosphoinositides) regulate the balance between tCK2 and mCK2 and, in turn, understand how they regulate different cellular processes, with particular attention to endocytosis. We were able to define the existence of a lipid binding pocket in Cka1 that resides close to the interface between catalytic and regulatory subunits, in a key region for the constitutive activity of CK2. Modelling the cavity we observed that it can accommodate phosphoinositides such as PI(4,5)P2 and PI4P and inositol polyphosphates as I(1,4,5)P3 or 5-IP7. Structural analysis revealed that Cka1 residues K75-78 bind preferentially to phosphates in position 5 from I(1,4,5)P3 or PI(4,5)P2, while R81, R194, N228 and R230 bind to phosphates located in positions 4 from I(1,4,5)P3, PI(4,5)P2, PI4P or 5 in 5-IP7. The mutation of residues R81, R194, N228, R230 (main) of Cka1 and Cka2 caused their disappearance in the cytosol after fractionations, probably by inducing their aggregation and degradation. We observed that binding to PI4P through R81, R194, N228 and R230 promoted the accumulation of mCK2, as indicated by the native PAGE results from Cka1-main mutant and after depleting the kinases and phosphatases involved in PI4P metabolism. On the contrary, results from Kcs1, the kinase responsible for the pyrophosphate 5-IP7, revealed that the binding of 5-IP7 to these same residues promoted the assembly of tCK2 probably by producing a conformational change in Cka1 β4/β5 loop. Furthermore, we found that the mCK2 isoform, elevated in kcs1∆ and ckb1∆ ckb2∆ mutants, accelerated the dynamics of Myo5, Sla1, Sla2, Ede1, reducing their time anchored to the plasma membrane during endocytosis. These mutants also exhibit higher rates of endocytic events per minute compared to WT cells. Conversely, in the Cka1-main mutant with increased tCK2, the opposite effect is observed, with prolonged lifespans of endocytic complexes and lower endocytic event ratio. Treatment with the CK2 inhibitor TBB, recovered WT dynamics in all of these mutants, indicating that both isoforms were able to phosphorylate endocytic coat components producing different outcomes. Finally, we conducted a phosphoproteome to identify other functional nodes in which mCK2 participated in addition to endocytosis. Results from mCK2 (ckb1∆ ckb2∆) revealed a pool of proteins downregulated, corresponding to exclusive targets of tCK2, but also a pool of upregulated proteins, which may correspond to targets exclusively phosphorylated by mCK2. Gene ontology analysis revealed that both downregulated and upregulated proteins were associated to same processes, being ribosome biogenesis more significant in the upregulated proteins and chromatin organization in the downregulated ones. Given that both groups shared some proteins and processes we hypothesize that, similar to endocytosis, the CK2 isoforms may be controlling the dynamics of protein complexes associated to these processes.

[SPA] CK2 es una cinasa serina/treonina constitutivamente activa formada por un tetrámero de dos subunidades catalíticas y dos reguladoras, llamadas en levadura Cka1, Cka2, Ckb2 y Ckb2. Las subunidades catalíticas poseen la actividad enzimática de CK2 independientemente de la presencia de las subunidades reguladoras, las cuales estabilizan el tetrámero y sirven como acopladoras de la mayoría de las proteínas diana. CK2 es crucial para la viabilidad celular y está involucrada en procesos como el crecimiento celular, la apoptosis o la respuesta a estrés, aunque su desregulación está asociada con enfermedades, especialmente cáncer. El aumento en la actividad y la expresión de las subunidades catalíticas, acompañado por una la disminución de las subunidades reguladoras promueve la progresión tumoral. Sin embargo, tanto la regulación de las dos isoformas de CK2 (tCK2 y mCK2) como las consecuencias biológicas de su alteración se desconocen. Investigaciones previas indican que la unión al fosfoinosítido PI(4,5)P2 producen el desensamblaje y la inactivación de tCK2. Durante la tesis profundizamos en el mecanismo por el cual PI(4,5)P2 (u otros fosfoinosítidos) regula el equilibrio entre tCK2 y mCK2, y cómo esto afecta a diferentes procesos celulares, especialmente en la endocitosis. Primero definimos en Cka1 una región de unión a lípidos situada cerca de la interfaz entre las subunidades catalíticas y las reguladoras. Al modelar la cavidad observamos que ésta puede alojar fosfoinosítidos como PI(4,5)P2 y PI4P, así como inositol polifosfatos como I(1,4,5)P3 o 5-IP7. En ella, los residuos de Cka1 K75-78 se unen preferentemente a los fosfatos situados en posición 5 de I(1,4,5)P3 o PI(4,5)P2, mientras que R81, R194, N228 y R230 se unen a fosfatos en posición 4 de I(1,4,5)P3, PI(4,5)P2, PI4P o 5 en 5-IP7. Mutando los residuos R81, R194, N228 y R230 (mutantes main) de Cka1 y Cka2 causamos su desaparición del citosol después de los fraccionamientos, probablemente por inducir agregados que son degradados. También observamos que la unión a PI4P a través de R81, R194, N228 y R230 promovió la acumulación de mCK2, tal y como indican los resultados del mutante Cka1-main y la depleción de las cinasas y fosfatasas involucradas en el metabolismo de PI4P. Por el contrario, los resultados del mutante kcs1∆, la cinasa responsable de la formación del pirofosfato 5-IP7, revelaron que la unión de 5-IP7 a estos mismos residuos acumula tCK2, probablemente induciendo un cambio conformacional en el bucle β4/β5 de Cka1. Además, descubrimos que mCK2, acumulada en kcs1∆ y ckb1∆ ckb2∆ aceleraba la dinámica de Myo5, Sla1, Sla2 y Ede1 durante la endocitosis, reduciendo su tiempo ancladas a la membrana plasmática. Estos mutantes también presentaban tasas más altas de eventos endocíticos por minuto. Por otro lado, en el mutante Cka1-main, con acumulación de tCK2, se observó el efecto opuesto: vidas más largas de los complejos endocíticos y una menor proporción de eventos. El tratamiento con el inhibidor de CK2, TBB, recuperó las dinámicas originales en todos estos mutantes, indicando que ambas isoformas estaban regulando a las diferentes proteínas, produciendo resultados opuestos. Finalmente realizamos un fosfoproteoma para identificar otros nodos funcionales en los que mCK2 participara además de la endocitosis. Los resultados de mCK2 (ckb1∆ ckb2∆) revelaron un grupo de proteínas reguladas a la baja, correspondientes a objetivos exclusivos de tCK2, pero también un grupo de proteínas reguladas a la alza, que podrían ser objetivos únicamente fosforilados por mCK2 El análisis ontológico reveló que las proteínas de los dos grupos estaban asociadas a los mismos procesos, siendo la biogénesis ribosomal más significativa en las proteínas reguladas a la alza y la organización de cromatina en las reguladas a la baja. Dado que ambos grupos comparten algunas proteínas y procesos, planteamos la posibilidad de que, al igual que en la endocitosis, las isoformas de CK2 puedan estar controlando la dinámica de los complejos proteicos asociados a estos procesos.