Regulación de la separasa mediada por el nuevo papel de Sak1 en mitosis

Abstract

[spa] El ciclo celular es un conjunto ordenado de sucesos que tienen como fin el crecimiento de una célula y su división en dos células hijas. Uno de los sucesos más relevantes en el ciclo celular es la correcta segregación del material genético de la célula parental a sus células descendientes durante la mitosis. Una proteína clave encargada de iniciar este proceso es la separasa, que lleva a cabo la escisión del complejo cohesina, permitiendo la separación de las cromátidas hermanas y su distribución en las células descendientes. Debido a la suma importancia que tiene para la célula este proceso para asegurar la correcta transmisión de la información genética a las células hijas, la separasa se encuentra altamente regulada a diferentes niveles durante la mitosis. Además de su función en el corte del complejo cohesina, la separasa también promueve la activación de la fosfatasa Cdc14, la elongación del huso mitótico y regula la condensación y resolución del ADN ribosómico. Pese a la relevancia de la separasa en el ciclo celular, no se conoce por completo como promueve todas las funciones que desarrolla en mitosis y aún quedan por resolver preguntas respecto a su regulación. En esta tesis utilizamos la levadura de gemación S. cerevisiae para estudiar nuevas funciones de la separasa y su regulación. Previamente, en este laboratorio se llevó a cabo un rastreo genético del alelo termosensible de la separasa, esp1-2, dónde se aislaron varios mutantes supresores de esp1-2 con el fin de identificar nuevos posibles sustratos de la separasa. En el trabajo realizado en esta tesis doctoral se validaron las mutaciones sak1-G150A y pah1-C549T como mutaciones supresoras del alelo esp1-2. Pah1 es una fosfatasa que regula la dinámica de síntesis de la membrana nuclear en respuesta a las señales metabólicas de la célula. Hemos demostrado que PAH1 y ESP1 interaccionan genéticamente, por lo que convierten a Pah1 y al supresor esp1-2 pah1-C549T en grandes candidatos para seguir estudiando nuevas funciones reguladas por la separasa. Por otro lado, Sak1 es la principal quinasa activadora de la vía de Snf1, que regula los cambios en el metabolismo de la célula en función de la disponibilidad de glucosa o diferentes tipos de estrés. Los resultados de este trabajo demuestran que Sak1 y la separasa interaccionan física y genéticamente, independientemente de la función de Sak1 activando a Snf1. También, hemos demostrado que el mutante supresor esp1-2 sak1-G150A recupera todas las funciones promovidas por las separasa en mitosis. El retraso en la liberación de la fosfatasa Cdc14 y la letalidad sintética con diferentes componentes de la vía MEN en el mutante Δsak1 señalan que Sak1 podría ser un componente de la vía FEAR. Además, nuestros resultados muestran que Sak1 fosforila a la separasa durante la mitosis y regula la localización nuclear de la separasa. Por consiguiente, los datos aportados por el trabajo de esta tesis doctoral postulan a la quinasa Sak1 como nuevo interactor de la separasa, regulando sus funciones y su localización subcelular durante la mitosis. Esta nueva conexión entre Sak1 y la separasa proporciona un gran avance en el conocimiento sobre la regulación de la separasa.

[eng] The cell cycle is a series of ordered events whose purpose is the growth of a cell and its division into two daughter cells. One of the most relevant events in the cell cycle is the correct segregation of genetic material from the parent cell to its daughter cells during mitosis. The key protein responsible for this process is separase, which carries out the cleavage of the cohesin complex allowing the separation of the sister chromatids and their distribution to the daughter cells. Due to the importance of this process for the cell, to ensure the correct transmission of genetic information to the daughter cells, separase is highly regulated at multiple levels during mitosis. In addition to its role in cleaving the cohesin complex, separase also promotes the activation of the Cdc14 phosphatase, the elongation of the mitotic spindle, and regulates the condensation and resolution of the ribosomal DNA. Despite the relevance of separase in the cell cycle, it is not fully understood how it promotes all its functions in mitosis, and there are still questions to be answered about its regulation. In this thesis, we used budding yeast S. cerevisiae to study new functions of separase and its regulation. Previously, a genetic screening of the temperature-sensitive separase allele , esp1-2, was performed in this laboratory, where several suppressor mutants of esp1-2 were isolated with the goal of identifying new potential substrates of separase. In the work carried out in this thesis, we validated the mutations sak1-G150A and pah1-C549T as suppressor mutations of the esp1-2 allele. Pah1 is a phosphatase that regulates the nuclear membrane dynamics in response to cell metabolic signals. We have demonstrated that PAH1 and ESP1 interact genetically, making Pah1 and the esp1-2 pah1-C549T suppressor mutant strong candidates for further study of new functions regulated by separase. On the other hand, Sak1 is the main activator kinase of the Snf1 pathway, which regulates changes in cell metabolism in response to the availability of glucose or different types of stress. The results of this work show that Sak1 and separase interact physically and genetically, independently of Sak1’s function in activating Snf1. Additionally, we have demonstrated that the esp1-2 sak1-G150A suppressor rescues all the functions promoted by separase in mitosis. The delay in the release of Cdc14 phosphatase and the synthetic lethality with different components of the MEN pathway in the Δsak1 mutant suggest that Sak1 could be a component of the FEAR pathway. Furthermore, our results show that Sak1 phosphorylates separase in mitosis and regulates its localization in the nucleus. Therefore, the data provided by the work in this thesis suggest that Sak1 is a new interactor of separase, regulating its functions and its subcellular localization during mitosis. This new connection between Sak1 and separase represents a significant advance in the understanding of the regulation of separase activity.