Nanotechnology-based approaches for bone tissue engineering

Abstract

(English) Substantial research efforts in the field of tissue engineering have been done in the recent years to overcome the bone regeneration limitations of the human body and to treat bone-related pathologies like osteosarcoma. Nanotechnology offers limitless ways to improve bone regeneration and to fight bone cancer by means of hydroxyapatite (HA) nanoparticles (NPs) and through the design of small organic molecules with capacity to trigger specific biological reactions. In the present thesis, the implementation of these molecules in cancer therapy and in the bone regeneration field is studied, and their interaction with biological systems is investigated.

Chapter 1 offers a general perspective of the topic and introduces the state of the art with the main strategies for bone cancer therapy and bone regeneration reported in the literature. Chapter 2 explores the use of hydroxyapatite nanoparticles for bone cancer therapies, with a view to elucidate the underlying cytotoxic mechanism. Moreover, the techniques commonly used to study the cellular uptake of these materials are compared with more novel characterisation alternatives. Indeed, implementation of cryo-soft X-ray tomography is presented as a key tool for tracking and monitoring the fate of internalised HA NPs, as it allows visualising both solid and liquid calcium deposits resulting from the dissolution of the nanomaterials. Chapter 3 investigates the use of gelatine microspheres (MS) as carriers of HA NPs for bone regeneration. Additionally, the ionic doping of these NPs with Mg2+, Zn2+ and Sr2+, with recognised benefits in the bone remodelling process, is studied and their release kinetics in cell culture medium is further quantified. Although dissolution and precipitation events take places simultaneously, MS demonstrate to be an effective method to deliver the therapeutical loaded ions. Chapter 4 and Chapter 5 focus on the design of bioinks as a strategy for bone tissue engineering. Alginate is chosen as the bioink binder due to its mild and straight-forward cross-linking process, as well as for its high tuneability and adequate rheological properties. Two different strategies are proposed to solve the poor bioactivity of this polymer to confer biological functionality to the cells embedded in the inks. Chapter 4 studies the incorporation of different types of MS (gelatine, gelatine containing HA NPs and calcium-deficient HA) to the formulation of these cell-laden inks. Furthermore, two cross-linking procedures are compared. Both, the addition of MS and the cross-linking using Ca2+-supplemented cell culture medium, result in increased stiffness of the bioinks. Importantly, the capacity of cells to migrate to the MS in the bioink formulation affected the cellular performance. In the case of inks loaded with gelatine-containing MS, promotion of cell migration, attachment and proliferation inside the bioink was observed, but this was not the case for the fully mineral MS, despite its superior osteogenic differentiation potential when cells were cultured directly onto the HA-containing MS. Finally, Chapter 5 explores the use of two peptidomimetics with selective activity towards a5ß1 and avß3 integrins, which play a crucial role in the osteogenic pathway. Alginate polymer is functionalised with these molecules prior to the preparation of the cell-laden inks. The use of both non-peptidic ligands results in enhanced osteogenic differentiation of the mesenchymal stem cells embedded in the bioinks. Besides, the boost of osteodifferentiation is higher than in the traditional RGD-coupled alginate hydrogels.

(Català) En els últims anys s'han fet un gran esforç de recerca en el camp de l'enginyeria de teixits per tal de superar les limitacions de regeneració òssia del cos humà, això com per tractar patologies relacionades amb l'os com és l'osteosarcoma. La nanotecnologia ofereix múltiples maneres de millorar la regeneració òssia i de lluitar contra el càncer d'os, gràcies a l'ús de nanopartícules d'hidroxiapatita (NPs HA) i a través del disseny de molècules orgàniques molt petites amb capacitat per desencadenar reaccions biològiques específiques. En aquesta tesi, s'estudia la implementació d'aquestes molècules en la teràpia anti-càncer i en el camp de la regeneració òssia, així com la seva interacció amb els sistemes biològics. El Capítol 1 ofereix una perspectiva general del tema i introdueix l'estat de l'art amb les estratègies pel tractament del càncer d'os i la regeneració òssia més comunes reportades en la literatura. En el Capítol 2 s'explora l'ús de les nanopartícules d'hidroxiapatita com a teràpia pel càncer d'os amb la intenció d'investigar-ne el mecanisme de citotoxicitat subjacent. A més, les tècniques més utilitzades per a l'estudi de la internalització cel·lular d'aquests materials es comparen amb alternatives de caracterització més innovadores. D'aquesta manera, la implementació de la crio-tomografia de raigs X tous es presenta com a una eina clau pel seguiment i monitorització del destí d'aquestes NPs internalitzades, ja que permet la visualització de dipòsits de calci en estat sòlid i líquid, que deriven de la dissolució del nanomaterial. En el Capítol 3 s'investiga l'ús de microesferes (MS) de gelatina com a portadores de NPs HA per a regeneració òssia. S'estudia el dopatge iònic de les NPs amb Mg2+, Zn2+ i Sr2+, que són ions molt implicats en el procés de remodelació òssia, i es quantifica la seva cinètica d'alliberació en medi de cultiu cel·lular. Tot i que hi ha processos de dissolució i precipitació simultanis, les MS demostren ser un mètode efectiu per alliberar els ions terapèutics carregats. El Capítol 4 i el Capítol 5 es centren en el disseny de biotintes en el camp de l'enginyeria de teixits ossis. S'escull l'alginat com a matriu, donat el seu procés d'entrecreuament simple i suau per a les cèl·lules, així com per la seva alta capacitat de modificació i les seves propietats reològiques. Es proposen dues estratègies diferents per a solucionar la falta de bioactivitat d'aquest polímer, i donar així funcionalitats biològiques a les cèl·lules incorporades a les biotintes. En el Capítol 4 s'estudia la incorporació de diferents tipus de MS (gelatina, gelatina amb NPs HA, i HA deficient en calci) per a la formulació d'aquestes biotintes. També es comparen dos protocols d'entrecreuament. Tant la incorporació de MS com l'entrecreuament usant medi de cultiu suplementat amb Ca2+ resulten en un increment en la rigidesa de les biotintes. També s'aprecia com la capacitat de migració de les cèl·lules cap a les MS en la formulació de les biotintes afecta el comportament cel·lular. En el cas de les tintes carregades amb MS que contenen gelatina, s'observa una promoció de la migració, adhesió i proliferació cel·lular dins les biotintes. D'altra banda, tot i la major capacitat de diferenciació osteogènica de les MS minerals quan les cèl·lules s'hi sembren a sobre, aquests altres fenòmens no s'hi veuen. Finalment, en el Capítol 5 s'explora l'ús de dos peptidomimètics amb activitat selectiva per a les integrines a5ß1 i avß3, que s'han vist molt implicades en la ruta osteogènica. El polímer d'alginat es funcionalitza amb aquestes molècules abans de preparar-ne biotintes. L'aplicació d'aquests dos lligands no peptídics resulta en una millor diferenciació osteogènica de les cèl·lules mare mesenquimals incorporades en les biotintes. A part, aquest estímul de l'osteodiferenciació és més important que en els hidrogels d'alginat funcionalitzats amb RGD, que és la solució tradicional.