Cold plasma-derived oxidative stress for osteosarcoma therapy

Abstract

(English) This thesis is framed in the ERC Starting Grant Project “Atmospheric Pressure plAsma meets biomaterials for bone Cancer HEaling (APACHE)”. The APACHE Project aims at evaluating plasma technology as therapy against bone cancer. At present, bone sarcomas are one of the cancers with worst prognosis and most difficult treatment. Among the different kinds of bone sarcomas, osteosarcoma (OS) has the highest incidence. Current therapies for OS, based on surgery, chemotherapy and radiotherapy, are not completely effective and present undesirable adverse effects. Cold atmospheric plasmas (CAP), consisting in highly reactive ionized gases, have been demonstrated to induce lethal effects in different kinds of cancers without damaging surrounding tissues. CAP are a source of a high amount of reactive oxygen and nitrogen species (RONS) that affect cancer cells by complex biochemical processes. These RONS are thought to be the main responsible of the effects of plasma in cancer cells, that are significantly more sensitive to them than non- malignant cells. These RONS can induce from cell cycle arrest at low plasma doses, to apoptosis at higher doses, as has been described for other cancers in in vitro and in vivo models. In spite of the knowledge of plasma effects in distinct types of cancer, the available studies about mechanisms involved in anti-tumor effect in OS are still limited. CAP can be used to produce RONS in liquids, known as plasma-conditioned liquids (PCL), that have been demonstrated to produce comparable effects to direct CAP treatment. Accordingly, the aim of this thesis is to investigate the application of this new therapy for OS by the use of PCL as a potential therapy for local treatment. For this purpose, in this PhD Thesis in Chapter 1 first the generation of RONS by CAP in plasma-conditioned culture media (PCM) is investigated and related with the cytotoxic effects induced in OS cells and non-malignant bone precursors. In Chapter 2, the cytotoxic effects of the PCL constituted by Ringer’s saline are evaluated at selective conditions in different OS cell lines and non-malignant bone precursors as well as in ex vivo mouse tumor tissues. In Chapter 3, the existing knowledge about CAP in OS and current challenges to overcome are reviewed and discussed. Finally, in Chapter 4 the effect of PCL is studied in different OS cultures, in 3D bioengineered tumor models and in an in vivo mouse models, focusing in the evaluation of antioxidant defenses, molecular pathways and the impact on OS subpopulations with stem properties. As main conclusion, we can confirm that PCL have shown efficient agents against OS through to the production of long-lived RONS, which determine the selective cytotoxic effect in OS and non-malignant cells. PCL are able to trigger anti-tumorigenic signaling and apoptotic cell death in OS cells by the induction of oxidative stress. However, insufficient levels of RONS may induce pro-survival factors of stress response in vitro and to be pro-tumorigenic in vivo. Specifically, cancer cells with elevated antioxidant ability, like cancer stem cells, display increased resistance to PCL. We have demonstrated that targeting the STAT3 transcription factor, we can inhibit the expression of antioxidant defenses and the cytotoxic effect of PCL can be enhanced, inducing cell death in OS PCL-resistant and cancer stem cells in vitro and effectively reducing tumor volume in vivo.

(Català) Aquest tesi s'emmarca en el projecte ERC Starting Grant “Atmospheric Pressure plAsma meets biomaterials for bone Cancer HEaling (APACHE)”. El projecte APACHE té com a objectiu avaluar la tecnologia de plasmes com a teràpia per al càncer d'os. Actualment, els sarcomes d'os són un dels càncers amb pitjor pronòstic i tractament més difícil. Entre els diferents tipus de sarcomes d'os, l'osteosarcoma (OS) és el que presenta major incidència. Les teràpies actuals per l'OS, basades en cirurgia, quimioteràpia i radioteràpia, no són completament efectives i presenten efectes adversos indesitjables. S'ha demostrat que els plasmes atmosfèrics freds (CAP), que consisteixen en gasos ionitzats altament reactius, indueixen efectes letals en diferents tipus de càncer sense danyar els teixits circumdants. Els CAP són una font de gran quantitat d'espècies reactives d'oxigen i nitrogen (RONS) que afecten les cèl·lules cancerígenes mitjançant processos bioquímics complexos. Es creu que les RONS són els principals responsables dels efectes del plasma en les cèl·lules cancerígenes, que són més sensibles a aquestes que les cèl·lules no malignes. Aquestes RONS poden induir des de la detenció del cicle cel·lular a dosis de plasma baixes, fins a l'apoptosi a dosis més altes, tal com s'ha descrit per altres càncers en models in vitro i in vivo. Malgrat el coneixement dels efectes dels plasmes en diferents tipus de càncer, els estudis disponibles sobre els mecanismes implicats en l'efecte anti-tumoral a l'OS encara són limitats. Els CAP es pot utilitzar per produir RONS en líquids, coneguts com a líquids condicionats per plasma (PCL), que s'han demostrat que produeixen efectes comparables al tractament directe amb CAP. Conseqüentment, l'objectiu d'aquesta tesi és investigar l'aplicació d'aquesta nova teràpia per al OS mitjançant l'ús de PCL com a teràpia potencial per fer un tractament local. Amb aquest propòsit, en aquesta Tesi Doctoral en el Capítol 1 primer s'investiga la generació de RONS per CAP en medis de cultiu condicionats per plasma (PCM) i es relaciona amb els efectes citotòxics induïts en cèl·lules OS i precursors ossis no malignes. En el Capítol 2, s'avaluen els efectes citotòxics del PCL constituït per la solució salina de Ringer en condicions selectives en diferents línies cel·lulars d'OS i precursors ossis no malignes, així com en teixits tumorals de ratolí ex vivo. En el Capítol 3 es revisen els coneixements existents sobre CAP en OS i es discuteixen els reptes actuals a superar. Finalment, a el Capítol 4 s'estudia l'efecte dels dos PCL en diferents cultius de OS i models 3D de tumor i en models in vivo de ratolí, centrant-se en l'avaluació de les defenses antioxidants, vies moleculars i l'impacte en les subpoblacions de OS amb propietats de cèl·lula mare. Com a principal conclusió, podem confirmar que els PCL constitueixen agents eficients contra l'OS mitjançant la producció de RONS de llarga vida, que determinen l'efecte citotòxic selectiu entre cèl·lules d'OS i les cèl·lules no malignes. Els PCL són capaços d’induir mort cel·lular per apoptosi i senyalització anti-tumorigènica en cèl·lules d'OS mitjançant la inducció d'estrès oxidatiu. Tanmateix, els nivells insuficients de RONS poden induir factors de supervivència com a resposta a l'estrès in vitro i ser pro-tumorigènics in vivo. Concretament, les cèl·lules canceroses amb una capacitat antioxidant elevada, com les cèl·lules mare cancerígenes, mostren una major resistència als PCL. Mitjançant el bloqueig del factor de transcripció STAT3, es pot inhibir l’expressió de les defenses antioxidants i millorar l'efecte citotòxic dels PCL, induint la mort cel·lular en cèl·lules d'OS resistents als PCL i cèl·lules mare cancerígenes in vitro i reduint de manera efectiva el volum del tumor in vivo.