Development of an in vitro three-dimensional colorectal cancer model using cell-derived extracellular matrices

Abstract

(English) Oncogenic pathologies are the second leading cause of death worldwide only after cardiovascular diseases. It is estimated that, by 2030, the number of patients diagnosed with this disease will increase by nearly a 70%, reaching 21 million cases per year (World Health Organization, WHO). From all these cases, only 35% of patients will successfully overcome the disease. Malignancies present a very heterogenous and unpredictable curse, often making the diagnosis and treatment, an arduous task for clinicians. In order to tackle the complexity of this disease, novel strategies have emerged, not only to investigate cancer cells, but also the cancer cell interactions with the other cell populations coexisting within the tumor microenvironment, as well as the extracellular matrix embedding all of them. Within the last 10 to 20 years, an increasing effort has been made to mimic native tumor properties in order to understand in vivo processes. Traditional 2D cultures are being replaced with more complex 3D scaffolds, where crucial aspects of cancer biology are replicated. Therefore, reproducing tumor architecture, biochemical composition and mechanical properties provides resident cells with multidimensional biochemical and mechanotransducive signaling cues, which results in an in vivo-like cell behavior. Based on the idea of providing complex 3D in vitro models to study cancer development and progression, I developed a 3D scaffold based on extracellular matrix deposited by mesenchymal cells, known as cell-derived extracellular matrix (CDM). In particular, I provided cells with a 3D microenvironment by culturing them on top of poly-lactic acid microcarriers. This 3D architecture, together with the addition of macromolecular crowders, enhanced cell ability to deposit their own extracellular matrix, ultimately resulting in the generation of cell-derived matrix scaffolds. The characterization of decellularized and microcarriers-free 3D matrices revealed a highly fibrillar structure based on its composition. Moreover, tailoring the production conditions of the matrices, I was able to obtain structures with varied composition as well as mechanical properties. Then, I repopulated CDMs with different colorectal cancer cell lines to generate a 3D in vitro cancer model. Repopulated CDMs showed a reduced cellular death in response to chemotherapeutic drugs, mimicking in vivo drug resistance provided by a biochemically and biomechanically complex 3D structure. Stromal cells, and in particular fibroblasts, are a key tumor microenvironment cell population that closely interacts with malignant cells. Cancer-associated fibroblasts (CAFs) play an important role in the remodeling and stiffening of the extracellular matrix surrounding tumor. In the present thesis, I studied the role of the progressively stiffer substrate upon normal fibroblasts and cancer-associated fibroblasts. Obtained results highlighted that, substrate/extracellular matrix stiffening is not enough for altered activation of healthy fibroblasts, but it plays an important role in the dysregulation of Hippo pathway in CAFs, a key signaling pathway involved in uncontrolled cell proliferation, tissue remodeling and abnormal growth processes. Finally, CDMs were repopulated with CAFs and colorectal cancer cell lines to study the interactions between the different cell types and the surrounding extracellular matrix scaffolds. Obtained results highlighted again the matrix remodeling potential of cancer-associated fibroblasts due to their interaction with malignant cells and the dysregulation of the Hippo pathway. In conclusion, this thesis highlights cell-derived matrices as a promising 3D in vitro model to study cancer disease development and progression, as CDMs mimic closely the native tumor microenvi-ronment properties. Further research in this field could potentially establish this platform as a fundamental tool for drug screening and target discovery assays.

(Català) Les malalties oncològiques són actualment la segona causa de mort a nivell mundial, només precedides per les malalties cardiovasculars. S'estima que al 2030, el nombre de pacients diagnosticats s'incrementarà en un 70%, sumant 21 milions de casos anuals. D'aquests, només el 35% de tots els pacients supera la malaltia. Les patologies cancerígenes són de naturalesa heterogènia i presenten un desenvolupament difícil de pronosticar. Amb l'objectiu de d'afrontar la complexitat d'aquesta malaltia, nombroses estratègies innovadores han aparegut durant els darrers anys, no només per estudiar les cèl·lules malignes, sinó per entendre les interaccions entre les subpoblacions cel·lulars del microambient tumoral (TME) i amb la matriu extracel·lular que les envolta. Durant els últims 10-20 anys, els esforços científics s'han centrat en mimetitzar diverses propietats dels tumors per tal d'entendre els diferent processos que hi tenen lloc. Els tradicionals cultius en 2D han estat reemplaçats per estructures 3D que reprodueixen l'arquitectura, composició i propietats mecàniques dels tumors. D'aquesta manera, la senyalització bioquímica i mecanoinductiva que les cèl·lules perceben resulta en un comportament més proper al existent en masses tumorals. Basant-nos en la idea de produir models in vitro d'alta complexitat per estudiar el desenvolupament i progressió del càncer, en aquesta tesi he desenvolupat una bastida 3D basada en matriu extracel·lular dipositada per les pròpies cèl·lules, el que s'anomenen matrius derivades de cèl·lules (CDMs). En concret, cultivant cèl·lules a la superície de micropartícules d'àcid poli-làctic he proporcionat un ambient 3D a les cèl·lules per què puguin generar bastides de CDMs. La caracterització de les matrius descel·lularitzades i sense micropartícules ha revelat una estructura de composició fibril·lar proteica. A més, modificant les condicions d'obtenció de les CDMs, he aconseguit produir estructures amb diferències tan en composició com en propietats mecàniques. Posteriorment, he repoblat les CDMs amb cèl·lules de càncer colorectal per generar un model tumoral in vitro. Assajos de citotoxicitat utilitzant fàrmacs de quimioteràpia han revelat la reducció de mortalitat en cèl·lules cultivades en les matrius generades, mimetitzant la resistència cel·lular in vivo proporcionada per una complexa estructura 3D, tan a nivell bioquímic, com biomecànic. Les cèl·lules de l'estroma, i en particular els fibroblasts, són una subpoblació clau en el TME, per la seva interacció amb cèl·lules malignes. Els fibroblasts associats al càncer (CAFs) juguen un paper clau en la remodelació i enduriment de la matriu extracel·lular que envolta el tumor. En aquesta tesi, he estudiat el rol de l'enduriment progressiu de la matriu extracel·lular en fibroblasts sans i associats al càncer. Els resultats obtinguts mostren que, tot i que l'enduriment de la matriu no és suficient per activar els fibroblasts, sí que juga un paper important en la desregulació de la ruta metabòlica Hippo, la qual està involucrada en la proliferació cel·lular descontrolada i la remodelació i creixement anormal de teixits. Finalment, les CDMs han estat repoblades amb CAFs i cèl·lules de càncer colorectal per estudiar les interaccions entre aquestes, i entre cèl·lules i matriu extracel·lular. Els resultats obtinguts ressalten de nou el potencial de remodelació per part dels fibroblasts associats al càncer degut a la seva interacció amb les cèl·lules tumoral i a la desregulació de la ruta metabòlica “hippo”. En resum, aquesta tesi emfatitza el futur prometedor de les CDMs com a models in vitro per estudiar el desenvolupament i progressió del càncer, degut a l'habilitat per mimetitzar el TME. La continuació d'aquest estudi pot establir les bases per al desenvolupament d'una eina clau per al cribratge de fàrmacs i el descobriment de dianes terapèutiques per a malalties oncològiques.