Análogos de DNA que incorporan nucleósidos con anillo de morfolina y grupos guanidino

Abstract

[spa] En la presente Tesis Doctoral se han ensayado diferentes metodologías para la obtención de un nuevo análogo oligonucleotídico con unidades catiónicas en su esqueleto, formadas por morfolinonucleósidos que se unen mediante enlaces guanidino (morfolino-amidinas). Mediante la metodología así desarrollada, se han conseguido preparar dos oligonucleótidos que contienen una unidad morfolino-amidina en el extremo 3 y en una posición central de la cadena y se han estudiado sus propiedades de hibridación mediante curvas de fusión. La síntesis de los oligonucleótidos que contienen la unidad morfolino-amidina se ha ensayado mediante dos rutas. La primera consiste en sintetizar la unidad dinucleosídica morfolino-amidina, para luego, convenientemente funcionalizada como derivado fosforamidito, actuar como sintón de la síntesis de oligonucleótidos. La segunda estrategia ensayada se basa en la formación del enlace guanidino en fase sólida por acoplamiento entre el derivado tiourea de un morfolinonucleósido y un aminonucleósido anclado a resina. Por lo que respecta a la primera estrategia, para preparar la subunidad dinucleosídica morfolino-amidina, se ensayaron diversos métodos de formación de guanidina. La elección de la metodología se realizó preparando un derivado modelo, por condensación de un derivado tiourea de morfolina y 5-amino-2,5-didesoxitimidina. Los ensayos concluyeron que la mejor opción consistía en preparar un intermedio activado de la tiourea por reacción con el reactivo de Sanger, que por reacción con el aminonucleósido daba lugar a la formación de la guanidina. En estos ensayos, también se estudiaron diversos grupos para proteger el grupo guanidino, resultando ser la mejor opción el grupo aliloxicarbonilo, ya que se podía eliminar cuantitativamente en condiciones compatibles con la estabilidad de los oligonucléotidos mediante la catálisis de paladio. Concluidos los ensayos, esta metodología se empleó en la síntesis de un dímero guanidino de morfolinouridina y aminodesoxitimidina, que convenientemente funcionalizo como derivado fosforamidito, se empleó para preparar el pentámero 5T(mUg(Alloc)T)TC, con rendimientos de incorporación que no superaban el 78%, valor bastante inferior a lo considerado óptimo para llevar a cabo una síntesis habitual. La baja incorporación del dinucleósido se puede atribuir a efectos estéricos del propio dinucleósido que dificultan la reacción de formación del enlace fosfito, que a la vez facilita la reacción de hidrólisis que compite con la de acoplamiento. Por tanto, se optó por evaluar una metodología sintética alternativa que no precisara de la preparación previa de la unidad dinucleosídica. También se observó que en la etapa de eliminación del grupo aliloxicarbonilo, que se realizaba sobre fase sólida, daba lugar, además del producto deseado, a una reacción secundaria de N-alilación de guanidina. Por lo que respecta a la segunda ruta, para llevar a cabo la síntesis de guanidinas en fase sólida, se ensayaron nuevamente diversos procedimientos. Inicialmente se ensayó la metodología ya ensayada en disolución, pero la pre-activación de la tiourea derivada de morfolinouridina con el reactivo de Sanger, para luego llevar a cabo el anclaje sobre 5-amino-2,5-didesoxitimidina anclada a la resina, en ninguno de los casos logró superar el 40% de incorporación. Como alternativa se decidió ensayar la activación in situ del derivado tiourea. Se obtuvieron los mejores resultados empleando el reactivo de Mukaiyama, obteniéndose un porcentaje de incorporación alrededor del 70%. El análisis de los crudos de reacción indicaba que en todos los casos se formaba el producto esperado y un producto secundario de la reacción entre el reactivo de Mukaiyama y el 5-aminonucleósido anclado al soporte. Posteriormente, se comprobó que esta reacción secundaria podía ser minimizada mezclando previamente el derivado tiourea y el reactivo de Mukaiyama, para luego tratar la resina con esta solución.

Posteriormente, se ensayó la eliminación del grupo Alloc en fase sólida sobre mUg(Alloc)T-succinilsarcosinil-resina. Se ensayaron diferentes tratamientos para conseguir una eliminación cuantitativa y minimizar la reacción secundaria de alilación del grupo guanidino. Por los ensayos realizados, se comprobó que se minimizaba la reacción secundaria empleando una concentración elevada de capturador. Mediante la metodología así desarrollada, se sintetizaron dos oligonucleótidos polipirimidínicos 14mer, que contenían una unidad morfolino-amidina (mUg(Alloc)T), el primero en el extremo 3 de la cadena (14E1), y el segundo en una posición central (14E2). En estos casos se observó que para poder eliminar el grupo Alloc era necesario realizar más de un tratamiento con paladio para conseguir una eliminación cuantitativa. Los oligonucleótidos así sintetizados se emplearon en los experimentos de formación de dobles y triples hélices, con el fin de explorar de forma preliminar las propiedades de hibridación de los oligonucleótidos que contienen unidades de morfolino-amidina. Los resultados obtenidos en los experimentos de hibridación, aunque preliminares, permiten deducir algunas pautas sobre el efecto de introducir subunidades morfolino-amidina (mUgT) en la estabilidad de dobles y triples hélices. Se concluye que una sola guanidina no es suficiente para estabilizar una doble hélice de DNA. Si la modificación se sitúa en un extremo de una de las cadenas hibridadas, la estabilidad es prácticamente idéntica a la no modificada pero el efecto es claramente desestabilizante si se modifica una posición central. No obstante, la introducción de las subunidades guanidino aumenta la estabilidad química y enzimática de las cadenas oligonucleotídicas. Con una sola subunidad guanidino, se observa la formación de triples hélices estables a pH neutro, condiciones en que la triple hélice no modificada no se forma. No obstante, el efecto de estabilización depende del pH (disminuye con el aumento de pH) y de la posición modificada en la secuencia oligonucleotídica. A la vista de algunos de los resultados, la subunidad morfolino-amidina puede producir una cierta distorsión estructural en las dobles y triples hélices, ya que la mayor estabilización se consigue modificando el extremo de unas de las cadenas.