Horizontal transfer to Salmonella of bacteriophage defence systems in the broiler intestinal tract and role of the plasmid-encoded ibfA gene as a defence mechanism

Abstract

La resistència als antibiòtics és una amenaça global preocupant, amb prediccions de fins a 10 milions de morts per al 2050. La teràpia fàgica és una alternativa als antibiòtics prometedora, però és necessari comprendre l'emergència de resistència i mecanismes de defensa front els bacteriòfags i els processos moleculars subjacents. El nostre grup prèviament havia aïllat set variants de Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC14028 RifR d’un estudi de teràpia fàgica en pollastres dengreix aplicant un còctel de tres bacteriòfags (UAB_Phi20, UAB_Phi78 i UAB_Phi87), que presentaven susceptibilitat reduïda als tres bacteriòfags o només a UAB_Phi78 i UAB_Phi87, no deguda a canvis en el seu receptor. Aquesta tesi pretén dilucidar les causes de la susceptibilitat reduïda als bacteriòfags del còctel observada en aquestes variants. L’estudi de la constant d’adsorció dels bacteriòfags UAB_Phi20 i UAB_Phi78 va mostrar que s’adsorbien normalment a les set variants, en canvi, UAB_Phi87 mostrava una adsorció compromesa. Els resultats de l’eficiència de plaqueig (EOP), l’eficiència de centres infectius (ECOI) i mida d’explosió, juntament amb els de cinètiques d’infecció prèvies, indicaven que la interferència contra els fags era compatible amb una infecció abortiva. L’anàlisi de les lectures no mapejades obtingudes amb Illumina va demostrar que les set variants portaven un plasmidi conjugatiu del grup d’incompatibilitat IncI1α. Experiments de conjugació i curació dels plasmidis van confirmar que aquests plasmidis eren totalment responsables de la interferència amb UAB_Phi20 i UAB_Phi78, i parcialment responsables de la interferència amb UAB_Phi87. Un d’aquests plasmidis, el pUA1135, contenia el gen ibfA dins de la seva regió variable, regions que s'ha suggerit porten gens de defensa contra fags. Aquest gen és homòleg al gen ibfA del plasmidi R64, relacionat amb la interferència amb diversos colifags i fags de S. Typhimurium, però el seu mecanisme d’acció és desconegut. La deleció i complementació d’ibfA va confirmar el seu paper en la defensa front UAB_Phi20. Addicionalment, l’anàlisi bioinformàtic de la proteïna IbfA va mostrar que consta d’un domini ATPasa i un TOPRIM, però, al contrari d’alguns sistemes de defensa contra fags, el domini ATPasa d’IbfA no és responsable d’interferir amb el cicle fàgic per esgotament d’ATP. El nostre estudi de la EOP, ECOI, cinètiques d’infecció i mida d’explosió va mostrar que ibfA redueix la productivitat d’UAB_Phi20, induint una disminució de la viabilitat cel·lular sense lisi cel·lular observable, confirmant que aquest gen provocava una infecció abortiva. L’observació per microscòpia electrònica de transmissió de seccions transversals de cèl·lules infectades va corroborar aquests resultats. Posteriorment, vam observar que ibfA no interferia en la replicació del genoma d’UAB_Phi20, en canvi, la seva presència causava una desregulació de l’expressió gènica del fag. En atenció als resultats obtinguts, proposem que IbfA, directament o indirectament, altera el control de l’expressió del gen ant, provocant el segrest de la proteïna C2 present a la cèl·lula. El desequilibri en la concentració de les proteïnes Cro/C2 resultant causa l’expressió elevada dels gens d’expressió primerenca, excepte del que codifica l’antiterminador tardà, que exhibeix una expressió reduïda deguda a l’elevada expressió de C1. Conseqüentment, disminueix l’antiterminació del transcrit tardà, que produeix una disminució significativa de l’expressió dels gens que codifiquen les proteïnes estructurals i de lisi cel·lular. En resum, en aquesta tesi es demostra per primera vegada, segons el nostre coneixement, que l’emergència de mecanismes de defensa contra bacteriòfags a Salmonella pot atribuir-se a l’adquisició de plasmidis conjugatius IncI1 per transferència horitzontal des de la microbiota de pollastres. També desxifrem el procés molecular, fins ara desconegut, subjacent a la defensa contra fags tipus P22, codificat pel gen ibfA, i descobrim l’àmplia distribució d’aquest gen en genomes i plasmidis de procariotes, suggerint que la seva presència podria conferir altres avantatges a aquestes cèl·lules.

La resistencia a los antibióticos se está convirtiendo en una amenaza global preocupante, con predicciones de hasta 10 millones de muertes para 2050. La terapia fágica es una prometedora alternativa a los antibióticos, pero es necesario comprender la emergencia de resistencia y mecanismos de defensa frente a bacteriófagos y los procesos moleculares subyacentes. Nuestro grupo ha aislado siete variantes de Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC14028 RifR de un estudio de terapia fágica en pollos de engorde utilizando un cóctel de tres bacteriófagos (UAB_Phi20, UAB_Phi78 y UAB_Phi87), que mostraron susceptibilidad reducida a los tres bacteriófagos o solo a UAB_Phi78 y UAB_Phi87, no causada por cambios en su receptor. Esta tesis pretende dilucidar las causas de la susceptibilidad reducida a los bacteriófagos del cóctel observada en dichas variantes. El estudio de la constante de adsorción de UAB_Phi20 y UAB_Phi78 mostró que se adsorbían normalmente a las siete variantes, pero UAB_Phi87 mostró una adsorción comprometida. Los resultados de la eficiencia de plaqueo (EOP), la eficiencia de centros infectivos (ECOI) y el tamaño de explosión, junto con los de cinéticas de infección previas, indicaron que la interferencia coincidía con una infección abortiva. El análisis de lecturas no mapeadas obtenidas con Illumina demostró que las siete variantes portaban un plásmido conjugativo del grupo de incompatibilidad IncI1α. Experimentos de conjugación y curación plasmídica confirmaron que dichos plásmidos eran totalmente responsables de la interferencia con UAB_Phi20 y UAB_Phi78, y parcialmente de la interferencia con UAB_Phi87. Uno de los plásmidos, pUA1135, contenía el gen ibfA en su región variable, regiones que se ha sugerido contienen genes de defensa contra fagos. Este es homólogo al gen ibfA del plásmido R64, que interfiere con varios colifagos y fagos de S. Typhimurium, aunque su mecanismo de acción es desconocido. La deleción y complementación de ibfA confirmó su papel en la interferencia con UAB_Phi20. Adicionalmente, análisis bioinformáticos de la proteína IbfA revelaron que consta de un dominio ATPasa y otro TOPRIM, pero, a diferencia de otros sistemas, el dominio ATPasa no es responsable de interferir con el ciclo fágico por agotamiento de ATP. Nuestro estudio de EOP, ECOI, cinéticas de infección y tamaño de explosión mostró que ibfA reducía la productividad de UAB_Phi20, induciendo un declive de la viabilidad celular sin lisis observable, confirmando que ibfA provocaba una infección abortiva. La observación, mediante microscopia electrónica de transmisión, de secciones transversales de células infectadas corroboró estos hallazgos. Posteriormente, observamos que ibfA no interfería en la replicación del genoma de UAB_Phi20, pero su presencia causó una desregulación de la expresión génica del fago. Según los resultados obtenidos, proponemos que IbfA, directa o indirectamente, altera el control de la expresión del gen ant, provocando el secuestro de la proteína C2 presente en la célula. El desequilibrio resultante en la concentración de las proteínas Cro/C2 provoca la expresión elevada de los genes de expresión temprana, excepto del que codifica el antiterminador tardío, que exhibe una expresión reducida debido a la elevada expresión de C1. Consecuentemente, la antiterminación del transcrito tardío disminuye, conduciendo a una disminución significativa de la expresión de los genes que codifican las proteínas estructurales y de lisis celular. En resumen, en esta tesis se demuestra por primera vez, según nuestro conocimiento, que la emergencia de mecanismos de defensa frente a bacteriófagos en Salmonella puede atribuirse a la adquisición de plásmidos conjugativos IncI1 por transferencia horizontal desde la microbiota de pollos. También desciframos el proceso molecular, hasta ahora desconocido, subyacente a la defensa contra fagos tipo P22, codificado en el gen ibfA, y descubrimos la amplia distribución de este gen en genomas y plásmidos de procariotas, sugiriendo que su presencia podría conferir ventajas a dichas células.

Antibiotic resistance is becoming an increasingly worrying global threat, with predictions foreseeing up to 10 million deaths by 2050. Phage therapy is a promising alternative strategy to antibiotics yet understanding the emergence of resistance and/or defence mechanisms against bacteriophage and their underlying molecular process is necessary. Our group has previously isolated seven Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC14028 RifR variants from an oral phage therapy study in broilers using a three-phage cocktail (UAB_Phi20, UAB_Phi78, and UAB_Phi87), which exhibited reduced susceptibility to either all three bacteriophages or only to UAB_Phi78 and UAB_Phi87, but without changes in the phage’s receptor. This thesis aims to elucidate the causes of the reduced susceptibility to the three bacteriophages observed in the seven Salmonella variants. Examining of the adsorption constant of the bacteriophages found that UAB_Phi20 and UAB_Phi78 adsorbed normally onto the seven variants, while UAB_Phi87 exhibited a compromised adsorption. Determination of efficiency of plating (EOP), efficiency of centres of infection (ECOI), and burst size, combined with prior infection kinetics, indicated that the interference against the phages was compatible with an abortive infection. Analysis of unmapped Illumina reads demonstrated that all seven variants carried a large IncI1α conjugative plasmid, which were fully responsible for the interference with UAB_Phi20 and UAB_Phi78, and partially responsible for interference with UAB_Phi87, as confirmed by conjugative experiments and plasmid curation. One of these plasmids, pUA1135, contained the ibfA gene within its variable region, regions which have been suggested to carry genes associated with phage defence. This gene shared homology with the ibfA gene of the R64 plasmid previously linked to interference against several coliphages and S. Typhimurium phages, although its mechanism of action remained undescribed. Deletion and complementation assays of ibfA confirmed its role in the interference with UAB_Phi20. Furthermore, examination of IbfA revealed it was a two-domain protein with an ATPase and a TOPRIM domain. However, unlike other defence systems, IbfA’s interference did not involve ATP depletion. Our study of EOP, ECOI, infection kinetics, and burst size, revealed that ibfA reduces UAB_Phi20 productivity, inducing a decline in cellular viability without observable cell lysis, confirming that this gene gives rise to an abortive infection. Using transmission electron microscopy on cellular cross sections of infected cells we corroborated these findings. Subsequently, we observed that ibfA exhibited no influence on the replication of UAB_Phi20 genome, however, a its presence caused a dysregulation of UAB_Phi20 gene expression. We propose that IbfA, directly or indirectly, disrupts the control of the expression of ant leading to the sequestering of the C2 protein present in the cell. The resulting imbalance in the Cro/C2 concentration, prompts the elevated early gene expression levels, except for the gene that encodes the late antiterminator, which exhibited a reduced expression due to the elevated C1 expression. Consequently, antitermination of the late transcript was diminished, leading to significant underexpression of late genes encoding cellular lysis and structural proteins. In summary, this thesis demonstrates for the first time to our knowledge, that the emergence of defense mechanisms against bacteriophages in Salmonella can be attributed to the acquisition by this bacterium of conjugative Inc1a plasmids by horizontal transfer from the microbiota of chickens. We also decipher the hitherto unknown molecular process underlying the defense against P22-type phage, encoded by the ibfA gene, and discover the wide distribution of this gene in prokaryotic genomes and plasmids, suggesting that its presence could confer other advantages to these cells.