Síntesi d’un pèptid terapèutic: Un estudi metodològic vers la producció a escala de planta pilot

Abstract

[cat] Tradicionalment, els fàrmacs de baix pes molecular (PM < 500 Da), coneguts com “molècules petites”, han predominat en el tractament de les malalties humanes, encara que en les últimes dècades els productes biològics de pes molecular elevat (PM > 5000 Da) han anat agafant força en el mercat gràcies als avanços en la biotecnologia, al permetre sintetitzar productes com proteïnes terapèutiques, anticossos o gens. No obstant, els pèptids terapèutics, definits com a compostos que es troben en la frontera entre les molècules petites tradicionals i les macromolècules d’origen biològic, són objectius molt rellevants en la recerca de nous fàrmacs pel que fa a la diversitat de funcions biològiques en les que intervenen, i representen un 10 % dels fàrmacs aprovats per l’Administració d’Aliments i Medicaments d’Estats Units (FDA) en els darrers 7 anys. Fins a la data, l’empresa Esteve Química ha centrat les seves investigacions i produccions en fàrmacs de molècules petites, i a partir de l’interès creixent de la comunitat farmacèutica en descobrir i desenvolupar nous pèptids terapèutics, l’empresa, junt amb la col·laboració de la Universitat de Barcelona, va decidir iniciar una línia d’investigació per a desenvolupar metodologies amb l’objectiu d’arribar a produir-los i comercialitzar-los. Amb aquest propòsit, un nou pèptid terapèutic de 17 aminoàcids anomenat Fexapotide Triflutat (FT), indicat pel tractament de la hiperplàsia benigna de pròstata (HBP) i que actualment es troba en espera per ser aprovat per la FDA per la seva comercialització, va ser el pèptid escollit per a dur a terme els estudis preliminars al laboratori i el posterior escalat del procés amb l’objectiu d’arribar a produir pèptids a escala de planta pilot a l’empresa. En l’inici d’aquesta col·laboració, es va dur a terme una Tesi Doctoral realitzada per Macarena Duran on es va proposar una estratègia sintètica per preparar FT a través d’una aproximació convergent, que consisteix en un enfoc híbrid de les dues opcions que es coneixen per sintetitzar químicament pèptids: la síntesi en fase sòlida (SPPS) i la síntesi en solució (SPS). El FT es va dividir en 3 fragments peptídics protegits: un dipèptid sintetitzat en solució i un hexapèptid i un nonapèptid sintetitzats en fase sòlida. Aquests fragments es van condensar en solució fins a obtenir el pèptid d’interès totalment protegit i en l’última etapa del procés es va desprotegir per obtenir FT. Com a resultat del treball preliminar, es van obtenir unes condicions experimentals adequades per a la obtenció de FT a escala de laboratori que, en la present Tesi Doctoral, s’han intentat millorar amb l’objectiu d’obtenir un procés eficient, ràpid, econòmic i segur, a més de complir amb els requeriments de les autoritats reguladores, per tal de poder portar la síntesi del pèptid d’interès a escala de producció. En aquesta investigació, s’ha posat especial atenció en el desenvolupament de mètodes analítics pel seguiment de les reaccions en fase sòlida per tal de superar un dels majors inconvenients de l’escalat de la fase sòlida. A més, s’han dissenyat nous reactors econòmics que permeten dur a terme l’escalat de la SPPS en reactors convencionals utilitzats en Esteve Química per a la síntesi en solució. A partir dels estudis de les reaccions d’acoblament d’aminoàcid i eliminació del grup Fmoc en SPPS es va poder dur a terme l’escalat de la síntesi dels fragments peptídics protegits, obtenint

28 g de l’hexapèptid i 37 g del nonapèptid amb pureses cromatogràfiques del 95,5 % i 96,5 % respectivament. L’estudi de les condicions experimentals en els acoblaments dels fragments peptídics en solució per donar el pèptid desitjat FT van permetre obtenir 26 g del precursor del FT amb una puresa cromatogràfica del 81,8 % i les millores condicions trobades per la desprotecció del precursor i obtenció de FT van portar a obtenir el pèptid terapèutic amb una riquesa per 1H-RMN de 92,2 %.

[eng] Therapeutic peptides are very relevant targets in the search for new drugs in terms of the diversity of biological functions in which they intervene and represent a 10 % of the drugs approved by the United States Food and Drug Administration (FDA) in the last 7 years. Due to the growing interest of the pharmaceutical community in discovering and developing new therapeutic peptides, Esteve Química, together with the collaboration of the University of Barcelona, decided to start a line of research to develop methodologies with the goal of producing and marketing them. For this purpose, Fexapotide Triflutate (FT), a new therapeutic peptide indicated for the treatment of Benign Prostatic Hyperplasia (BPH), was the peptide chosen to carry out the preliminary studies in the laboratory and the subsequent scale-up of the process with the aim of producing peptides on a pilot plant scale in the company. In the studies preceding this Doctoral Thesis, suitable experimental conditions have been obtained for the synthesis of FT on a laboratory scale. In the present Doctoral Thesis, these conditions have been tried to be improved with the aim of obtaining an efficient, fast, economical and safe process to bring the synthesis of aim peptide to production scale. In this research, special attention has been paid to the development of analytical methods for monitoring reactions using Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS), as it was one of the major drawback of large-scale SPPS. Furthermore, new economic reactors have been designed that allow the scaling up of SPPS in conventional reactors used in Esteve Química for synthesis in solution. Finally, the studies of the solid phase synthesis and of the condensations of the peptide fragments in solution have allowed the process to be scaled up to obtain 26 g of protected peptide. Deprotection of the peptide to obtain FT was studied and in the best test the therapeutic peptide was obtained with a 1H-NMR assay of 92.2%.