Characterization of the 40S-LARP1 complex in a model of ribosome biogenesis-addicted tumors

Abstract

[eng] In the process of neoplastic transformation, hyperactivation of proliferative signaling and the deregulation of cellular metabolism are required to ensure uncontrolled cellular growth and proliferation as well as high levels of energy production. To do so, hyperactivation of key oncogenes like MYC and oncogenic pathways such as mTOR, PI3K/AKT, Ras/MEK and WNT/β-catenin are essential to maintain high levels of protein synthesis and to sustain the production of ribosomes, the proteins factories of the cell. Ribosomes are ribonucleoprotein complexes composed by 80 ribosomal proteins (RPs) and 4 rRNA. The generation of new ribosomes is a multi-step and high energy- demanding process that requires a tight regulation from transcription to translation and beyond. In this regard, the production of RP is coordinated at the post-transcriptional level through a cis-element, termed Terminal Oligopyrimidine (TOP) motif, present at the transcriptional start site of their cognate transcripts. mTOR, which senses the external and internal metabolic cues in the cell, acts as a translational switch of this family of 5'TOP mRNAs accordingly. Our group has discovered that 5'TOP mRNAs are stabilized and preserved in a biochemical complex composed by the RNA-binding protein LARP1 and the small ribosomal subunit 40S, and that mTOR inhibition triggers the formation of the 40S-LARP1-5'TOP complex. Importantly, we recently described that the 40S-LARP1-5'TOPs complex acts as an anabolic storage in the form of stable pools of translationally-inactive mRNAs upon restrained metabolic limitations characterized by mTOR inhibition such as treatment with pharmacological inhibitors or by amino acid or serum deprivation. This reservoir of anabolic capacity can be rapidly spent by the cells to generate new ribosomes when conditions return permissive and mTOR is reactivated, suggesting that the mTOR / 40S-LARP1 axis could constitute a cell instrinsic mechanism of metabolic resistance to adverse growth conditions. This might have important implications in the process of tumorigenesis and in the treatment of cancers addicted to ribosome biogenesis. However, little is known regarding the formation of this biochemical complex and its molecular makeup in response to limiting metabolic constraints. To this end, we have characterized the 40S-LARP1 complex interactome in 1

normal growing conditions and under different mTOR inhibiting conditions by Mass Spectrometry. This characterization has shown that the 40S-LARP1 complex interacts with proteins involved in multiple steps of RNA regulation and translation as well as ribosome biogenesis, mitochondrial translation or intracellular organization. An initial analysis on the functional role of the 40S-LARP1 complex(es) interactors has revealed that the RNA binding protein ILF3 and the mitochondrial protein PHB1 are new players in the regulation of 5'TOP mRNAs. Of note, the interaction of the 40S-LARP1 complex with these two partners does not appear to be concomitant, pointing to a model of different 40S-LARP1 complexes co-existing in the cell at the same time. Indeed, LARP1 colocalizes with PHB1 in the mitochondria, which might confer specific functions to the 40S-LARP1 complex confined to such subcellular compartment and distinct of other 40S- LARP1 complexes. Intriguingly, ILF3 and PHB1 have been already described as negative prognostic markers in cancer and chemoresistance, respectively, suggesting a potential role of the 40S-LARP1 anabolic reservoir in those contexts. Furthermore, we have evaluated the subcellular localization of LARP1 protein, which we have proved to be widespread and mainly cytoplasmic but sensitive to the mTOR pathway. We have observed that LARP1 increases its co-localization with markers of the endoplasmic reticulum and the mitochondria upon mTOR inhibition. Understanding this will shed light on the metabolic pathways fed by the anabolic storage, and consequently on new potential targets in RiBi-addicted cancers.

[cat] Les cèl·lules cancerígenes requereixen alts nivells de síntesi de proteïnes per mantenir el creixement tumoral. D'aquesta manera, en molts tipus de tumors com el càncer colo-rectal, la síntesi de ribosomes es troba freqüentment hiperactivada per assolir l'alta demanda anabòlica. El nostre grup ha descobert un complex bioquímic compost per la proteïna d'unió a ARN LARP1 i la subunitat petita del ribosoma 40S que estabilitza la família the ARNm 5'TOP, els quals codifiquen components de la síntesi de ribosomes. Sota condicions de creixement desfavorables que deriven en la inhibició de mTOR, el principal sensor del metabolisme cel·lular, el complex 40S-LARP1 protegeix els trànscrits 5'TOP en condicions de supressió de la traducció. Sota aquestes condicions, el complex 40S-LARP1-ARNms 5'TOP actua com un emmagatzematge de poder anabòlic, el qual les cèl·lules poden utilitzar per generar nous ribosomes i, per tant, nova capacitat de síntesi de proteïnes, quan els senyals interns i externs tornen a ser favorables. Tanmateix, es desconeix com aquest complex bioquímic es forma en resposta a les condicions metabòliques restrictives, així com la seva composició molecular. Amb aquest objectiu, hem caracteritzat l' interactoma del complex 40S-LARP1 sota diferents condicions d' inhibició de mTOR per espectrometria de masses. Aquesta caracterització ha demostrat que el complex 40S-LARP1 interacciona amb proteïnes relacionades amb esdeveniments de la regulació d' ARN i la traducció així com síntesi de ribosomes, traducció mitocondrial i organització intracel·lular. Una anàlisi funcional ha revelat que la proteïna d'unió a ARN ILF3 i la proteïna mitocondrial PHB1 són potencials nous reguladors dels trànscrits 5'TOP. De manera destacable, ILF3 i PHB1 han estat descrits com a marcadors negatius de pronòstic en càncer i en resistència a quimioteràpics, respectivament, suggerint nous papers del reservori anabòlic 40S-LARP1 en aquests contextos. Aquest coneixement ajudarà a desxifrar les rutes metabòliques a les quals aquest emmagatzematge subministra i, per tant, noves dianes en càncers addictes a la síntesi de ribosomes.

[spa] Las células cancerígenas requieren altos niveles de síntesis de proteínas para mantener el crecimiento tumoral. De esta forma, en muchos tipos de tumores como el cáncer colo-rectal, la síntesis de ribosomas se encuentra frecuentemente hiperactivada para alcanzar la alta demanda anabólica. Nuestro grupo ha descubierto un complejo bioquímico compuesto por la proteína de unión a ARN LARP1 y la subunidad pequeña del ribosoma 40S que estabiliza la familia the ARNm 5’TOP, los cuales codifican componentes de la síntesis de ribosomas. Bajo condiciones de crecimiento desfavorables que derivan en la inhibición de mTOR, el principal sensor del metabolismo celular, el complejo 40S-LARP1 protege los tránscritos 5’TOP en condiciones de supresión de la traducción. Bajo estas condiciones, el complejo 40S-LARP1-ARNms 5’TOP actúa como un almacenamiento de poder anabólico, el cual las células pueden utilizar para generar nuevos ribosomas y, por tanto, nueva capacidad de síntesis de proteínas, cuando las señales internas y externas vuelven a ser favorables. Sin embargo, se desconoce cómo este complejo bioquímico se forma en respuesta a las condiciones metabólicas restrictivas, así como su composición molecular. Con este objetivo, hemos caracterizado el interactoma del complejo 40S-LARP1 bajo diferentes condiciones de inhibición de mTOR por espectrometría de masas. Esta caracterización ha demostrado que el complejo 40S-LARP1 interacciona con proteínas relacionadas con eventos de la regulación de ARN y la traducción así como síntesis de ribosomas, traducción mitocondrial y organización intracelular. Un análisis funcional ha revelado que la proteína de unión a ARN ILF3 y la proteína mitocondrial PHB1 son potenciales nuevos reguladores de los tránscritos 5’TOP. De manera destacable, ILF3 y PHB1 han sido descritos como marcadores negativos de pronóstico en cáncer y en resistencia a quimioterápicos, respectivamente, sugiriendo nuevos papeles del reservorio anabólico 40S-LARP1 en dichos contextos. Este conocimiento ayudará a descifrar las rutas metabólicas a las cuales este almacenamiento suministra y, por tanto, nuevas dianas en cánceres adictos a la síntesis de ribosomas.