Mechanisms of the Asc1 amino acid transporter

Abstract

[eng] The Asc1 amino acid transporter is involved in several basic processes of the central nervous system, such as N-methyl-D-aspartate receptor mediated excitation and glycinergic inhibition of signal transmission, having thus potential as a therapeutic target to treat neurological disorders such as schizophrenia, amyotrophic lateral sclerosis and hyperekplexia. In the present project, we aimed to determine the high-resolution atomic structure of Asc1 in complex with CD98hc using Cryo-EM and to dissect the molecular mechanisms that underlie its transport function, therefore laying the groundwork for future research to develop more efficient drugs against the aforementioned neurological disorders. The structure of the Asc1/CD98hc complex has been determined at a resolution of 4 Ǻ, with local resolution reaching 3.4-3.8 Ǻ for most of the map. The transporter has been captured in a hitherto unknown semi- occluded conformation, in which the transmembrane helix (TM) 1a is in an intermediate position between a transporter fully open to the cytosol and one completely occluded. Interestingly, in this apo structure a connection can be observed between the bundle (TM1, 2, 6, 7) and scaffold (TM3, 4, 5, 8, 9, 10) domains through a polar contact between Ser 246 (TM6) and Tyr 333 (TM8). Recalling previous studies with prokaryotic homologues, which proved the importance of this kind of interactions between domains for substrate translocation, the functional relevance of the Ser 246 – Tyr 333 was studied. Although the Cryo-EM structure was obtained from a protein preparation incubated with 10 mM D-serine the resulting structure was in a substrate- free apo state. To surmount this limitation, Protein Energy Landscape Exploration (PELE) was carried out with the newly determined Asc1 structure, allowing us to identify a series of residues key for determining substrate selectivity in Asc1: Ser 56, Ser 246 and Tyr 333. The impact of mutating these residues on the uptake of radiolabelled substrate was

measured, revealing that all three residues are essential for the transport of the canonical Asc1 substrates, i. e., small neutral amino acids, but not larger substrates. Moreover, the impact of mutating these residues on both modes of transport presented by Asc1, exchange and facilitated diffusion, was assessed. Efflux experiments in HeLa cells with the mutants S246G and Y333F revealed that these residues are essential for exchange, but also result in a slower inward return of the empty transporter, thus supporting also a role of Ser 246 and Tyr 333 in sustaining facilitated diffusion. Molecular dynamics of L-alanine binding in our structure largely confirmed the observations from the PELE analysis although, surprisingly, in one of the trajectories TM1a opened the cytosolic vestibule and the substrate was released to the cytosol. In this replica, initially Tyr 333 competed with Ser 56 for binding with the substrate carboxyl. The rotation of Tyr 333 towards TM6 dragged the substrate away from the unwound region of TM1, and upon disconnection of the substrate from TM1, TM1a started to open the cytosolic gate. The binding of the side chain of Ser 246 to L-alanine, which we had also observed in one of the PELE poses, could be stabilising an intermediate stage in which Tyr 333 has rotated towards TM6 but the substrate remains bound to Ser 56. We propose a model in which the interaction of the substrate with the side chains of Ser 246 and Tyr 333 allows its proper positioning between the unwound regions of TM1 and TM6 to trigger translocation. This model is supported by kinetic analysis of L-alanine and D-serine uptake of the mutants S246G and Y333F, which decrease the maximal velocity of the transporter.

[cat] El transportador d'aminoàcids Asc1 està implicat en diversos processos bàsics del sistema nerviós central, com l'excitació mediada pel receptor N-metil-D-aspartat i la inhibició glicinèrgica de la transmissió del senyal, tenint així potencial com a diana terapèutica per tractar trastorns neurològics com l'esquizofrènia, l'esclerosi lateral amiotròfica i la hiperekplexia. En el present projecte, el nostre objectiu era determinar l'estructura atòmica d'alta resolució d'Asc1 en complex amb CD98hc mitjançant Cryo-EM i disseccionar els mecanismes moleculars que subjauen a la seva funció de transport, establint així les bases per a futures investigacions per desenvolupar fàrmacs més eficients contra els trastorns neurològics esmentats. L'estructura del complex Asc1/CD98hc s'ha determinat amb una resolució de 4 Ǻ, amb una resolució local de 3,4-3,8 Ǻ per a la major part del mapa. El transportador ha estat capturat en una conformació semi-oclusa fins ara desconeguda, en la qual l'hèlix transmembrana (TM) 1a es troba en una posició intermèdia entre un transportador completament obert al citosol i un completament ocluït. Curiosament, en aquesta estructura apo es pot observar una connexió entre els dominis del feix (TM1, 2, 6, 7) i la bastida (TM3, 4, 5, 8, 9, 10) a través d'un contacte polar entre Ser 246 (TM6) i Tyr 333 (TM8). Recordant estudis previs amb homòlegs procariotes, que van demostrar la importància d'aquest tipus d'interaccions entre dominis per a la translocació de substrats, es va estudiar la rellevància funcional del Ser 246 – Tyr 333. Tot i que l'estructura Cryo-EM es va obtenir a partir d'una preparació de proteïnes incubada amb 10 mM de D-serina, l'estructura resultant estava en un estat apo lliure de substrat. Per superar aquesta limitació, es va dur a terme Protein Energy Landscape Exploration (PELE) amb la nova estructura Asc1, que ens va permetre identificar una sèrie de residus clau per determinar la selectivitat del substrat en Asc1: Ser 56, Ser 246 i Tyr 333. L'impacte de la mutació d'aquests residus en l'absorció de substrat radiomarcat va ser

mesurat, revelant que els tres residus són essencials per al transport dels substrats canònics Asc1, és a dir, aminoàcids neutres petits, però no substrats més grans. A més, es va avaluar l'impacte de la mutació d'aquests residus en els dos modes de transport presentats per Asc1, l'intercanvi i la difusió facilitada. Els experiments d'eflux en cèl·lules HeLa amb els mutants S246G i Y333F van revelar que aquests residus són essencials per a l'intercanvi, però també donen lloc a un retorn més lent cap a l'interior del transportador buit, donant suport també a un paper de Ser 246 i Tyr 333 en el manteniment de la difusió facilitada. La dinàmica molecular de la unió a la L-alanina en la nostra estructura va confirmar en gran mesura les observacions de l'anàlisi PELE, tot i que, sorprenentment, en una de les trajectòries TM1a va obrir el vestíbul citosòlic i el substrat va ser alliberat al citosol. En aquesta rèplica, inicialment Tyr 333 va competir amb Ser 56 per unir-se amb el substrat carboxil. La rotació de Tyr 333 cap a TM6 va arrossegar el substrat lluny de la regió desenrotllada de TM1, i després de desconnectar el substrat de TM1, TM1a va començar a obrir la porta citosòlica. La unió de la cadena lateral de Ser 246 a la L-alanina, que també havíem observat en una de les postures PELE, podria estar estabilitzant una etapa intermèdia en què Tyr 333 ha girat cap a TM6 però el substrat roman lligat a Ser 56. Proposem un model en el qual la interacció del substrat amb les cadenes laterals de Ser 246 i Tyr 333 permet el seu correcte posicionament entre les regions desenrotllades de TM1 i TM6 per desencadenar la translocació. Aquest model està recolzat per l'anàlisi cinètica de l'absorció de L-alanina i D-serina dels mutants S246G i Y333F, que disminueixen la velocitat màxima del transportador.