DNA repair in cancer therapeutics: developing a specific inhibitor for tumors and targeted therapies to treat solid tumors in rare diseases

Abstract

La ruta de reparació de l’anèmia de Fanconi (FA)/BRCA és un mecanisme emprat en la reparació de danys en el DNA davant la presència d’enllaços creuats entre cadenes, causats ocasionalment o per agents quimioterapèutics. La reparació del DNA és un objectiu important en la teràpia dirigida contra el càncer, i suposa una alternativa a les teràpies convencionals. Després del descobriment de la letalitat sintètica, mot utilitzat per a referir-se a la relació genètica establerta entre dos gens la pèrdua de funció dels quals desemboca en la mort cel·lular, mentre que la pèrdua de funció de tan sols un d’ells no, s’han desenvolupat diversos enfocaments terapèutics en base a aquesta relació. Un exemple en són els inhibidors de la PARP (PARPi), aprovats per al tractament de càncer de mama, ovari, pròstata o pàncrees en tumors amb mutacions en BRCA1/2. Aquesta tesi és la continuació d'un projecte de descobriment de fàrmacs (drug discovery) amb l'objectiu de trobar un inhibidor de la via FA/BRCA (Fanconinib), que pugui ser utilitzat per tractar tumors amb mutacions letals sintètiques amb la via esmentada, com PARP, ATM, ATR o ALDH2. Després d'aquesta caracterització, es va dur a terme un primer cribratge de compostos a partir d'una biblioteca amb 136 milions de molècules (base de dades 3D ZINC15). seguit de la validació cel·lular/in vitro i de la seva interacció amb l'objectiu (validació bioquímica). Alguns dels candidats dissenyats i provats van mostrar bons resultats sense toxicitat en les cèl·lules tractades. Tot i que queden molts passos per fer, les perspectives a la vista dels nostres últims resultats són prometedores per al futur del nostre projecte de descobriment de fàrmacs.

D'altra banda, la manca d'una via FA/BRCA funcional és l'origen d'un rar trastorn genètic caracteritzat, principalment, per insuficiència medul·lar, anomalies físiques i major risc de càncer. De fet, el desenvolupament de carcinomes escamosos de cap i coll (HNSCC) en pacients amb anèmia de Fanconi és entre 500 i 800 vegades major que en la població general, al qual s'afegeix l'inconvenient addicional que aquests pacients no poden sotmetre's a quimio- o radioteràpia a causa de la pèrdua del mecanisme de reparació d'enllaços creuats entre cadenes. A causa d'aquesta intolerància a la radio/quimioteràpia, la resecció quirúrgica és l'única teràpia aprovada per a aquest tipus de tumors en pacients Fanconi. No obstant això, el 2020 es va publicar un estudi fet pel nostre grup, en el qual a partir d'un cribratge d'alt contingut es va identificar a afatinib, inhibidor panERBB, com un prometedor agent antitumoral i no genotòxic per a pacients Fanconi (Montanuy, et al., 2020a and 2020b). A més, l'amplificació d'EGFR ha estat recentment observada en FA HNSCC (Webster et al., 2022). Mentre el nostre grup intenta demostrar l'eficàcia i seguretat d'afatinib en pacients Fanconi amb HNSCC a través d'un assaig clínic de reposicionament, multicèntric i internacional; i tenint en compte que els tumors solen desenvolupar resistència a aquests tipus de teràpia, limitant la seva eficàcia a llarg termini, el nostre objectiu es va centrar a identificar noves dianes terapèutiques per als tumors FA HNSCC resistents a afatinib. Considerant que les línies FA HNSCC exhibien 20-50 vegades menys resistència a afatinib que les línies esporàdiques (afatinib 20-45-80 nM vs. 800-1.000 nM), vam intentar establir els principals mecanismes diferencials entre línies esporàdiques i Fanconi, resistents i no resistents a afatinib. Tot i que la baixa adquisició de resistència a afatinib en línies FA HNSCC recolza l'ús d'aquest inhibidor en assajos clínics, la identificació de potencials dianes terapèutiques amb expressió diferencial en les dades de transcriptòmica obtingudes obre la porta a noves estratègies contra tumors HNSCC en pacients.

La ruta de reparación de anemia de Fanconi (FA)/BRCA es un mecanismo de reparación de daño en el DNA ante la presencia de enlaces cruzados entre cadenas (interstrand crosslinks), causados espontáneamente o por agentes quimioterapéuticos. La reparación del DNA es un objetivo importante en la terapia dirigida contra el cáncer, y supone una alternativa a las terapias convencionales. En este ámbito, la letalidad sintética, término usado para referirse a la relación genética que se establece entre dos genes cuya pérdida de función desemboca en la muerte celular, mientras que la pérdida de función de solo uno de ellos no, está siendo considerada en diferentes enfoques terapéuticos contra el cáncer. Un ejemplo de ello son los inhibidores de la PARP (PARPi), aprobados para el tratamiento de cáncer de mama, ovario, próstata o páncreas en tumores con mutaciones en BRCA1/2.  Esta tesis es continuación de un proyecto de descubrimiento de fármacos (drug discovery) cuyo objetivo es encontrar un inhibidor de la ruta de FA/BRCA (Fanconinib), que pueda ser usado para tratar tumores con mutaciones letales sintéticas con la ruta mencionada, como PARP, ATM, ATR o ALDH2. Después de esta caracterización, se llevó a cabo un primer cribado de compuestos a partir de una librería con 136 millones de moléculas (base de datos 3D ZINC15). seguidas de la validación celular/in vitro y de su interacción con el objetivo (validación bioquímica). Algunos de los candidatos diseñados y probados mostraron buenos resultados sin toxicidad en las células tratadas. Aunque quedan muchos pasos por hacer, las perspectivas a la vista de nuestros últimos resultados son prometedores para el futuro de nuestro proyecto de descubrimiento de fármacos. Por otra parte, la falta de una ruta FA/BRCA funcional es el origen de un raro desorden genético caracterizado, principalmente por fallo de médula ósea, anomalías físicas y mayor riesgo de cáncer. De hecho, el desarrollo de carcinomas escamosos de cabeza y cuello (HNSCC) en pacientes con anemia de Fanconi es entre 500 y 800 veces mayor que en población general, a lo que se suma el inconveniente adicional de que estos pacientes no pueden someterse a quimio- o radioterapia debido a la pérdida del mecanismo de reparación de enlaces cruzados entre cadenas. A causa de esta intolerancia a la radio/quimioterapia, la resección quirúrgica es la única terapia aprobada para este tipo de tumores en pacientes Fanconi. Sin embargo, en 2020 se publicó un estudio hecho por nuestro grupo, en el que a partir de un cribado high content screening se identificó a afatinib, inhibidor panERBB, como un prometedor agente antitumoral y no genotóxico para pacientes Fanconi (Montanuy, et al., 2020a and 2020b). Además, la amplificación de EGFR ha sido recientemente observada en FA HNSCC (Webster et al., 2022). Mientras nuestro grupo intenta demostrar la eficacia y seguridad de afatinib en pacientes Fanconi con HNSCC a través de un ensayo clínico de reposicionamiento, multicéntrico e internacional; y teniendo en cuenta que los tumores suelen desarrollar resistencia a estos tipos de terapia, limitando su eficacia a largo plazo, nuestro objetivo se centró en identificar nuevas dianas terapéuticas para los tumores FA HNSCC resistentes a afatinib. Considerando que las líneas FA HNSCC exhibían 20-50 veces menos resistencia a afatinib que las líneas esporádicas (afatinib 20-45-80 nM vs. 800-1.000 nM), intentamos establecer los principales mecanismos diferenciales entre líneas esporádicas y Fanconi, resistentes y no resistentes a afatinib. Aunque la baja adquisición de resistencia a afatinib en líneas FA HNSCC apoya el uso de este inhibidor en ensayos clínicos, la identificación de potenciales dianas terapéuticas con expresión diferencial en los datos de transcriptómica obtenidos abre la puerta a nuevas estrategias contra tumores HNSCC en pacientes.

Fanconi anemia (FA)/BRCA pathway is a DNA damage repair pathway whose main function is to solve interstrand crosslinks that occur spontaneously or when cells are under the presence of chemotherapeutic agents. DNA repair is gaining relevance as targeted therapy against cancer, offering an alternative to conventional therapies. In this field, synthetic lethality, term used to refer to the genetic relationship stablished between two genes in which the loss of function of both results in cell death, but the loss of one of either of the two genes does not, has been taken into consideration for some cancer therapeutic approaches. This is the case of PARP inhibitors are approved to treat breast, ovarian, prostate and pancreas cancer with BRCA1/2 mutations. This thesis is a continuation of a drug discovery project aimed at finding a FA/BRCA pathway inhibitor (Fanconinib) that could be used for cancer treatment in presence of mutations that have synthetic lethal interactions with the mentioned pathway, such as PARP, ATM, ATR or ALDH2. After characterizing the target, an initial compound screening was conducted using a library of 136 million molecules (3D ZINC15 database). Subsequent cellular/in vitro validation and biochemical validation of the target-compound interaction were performed. Some of the designed and tested candidates showed promising results without toxicity in treated cells. Although there are more steps to be taken, the outlook based on our latest results is promising for the future of our drug discovery project.

On the other hand, the lack of a functional FA/BRCA pathway is the root cause of a rare genetic disorder characterized primarily by bone marrow failure, physical abnormalities, and an increased risk of cancer. In fact, head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) develops 500-800 times more frequently in Fanconi anemia patients compared to the general population. Additionally, these patients cannot undergo chemotherapy or radiotherapy due to the loss of the interstrand crosslink repair mechanism. Due to this radio/chemotherapy intolerance, surgical resection is the only approved therapy for this type of tumor in Fanconi patients. However, a 2020 study by our group, using high-content screening, identified afatinib, a panERBB inhibitor, as a promising non-genotoxic anti-tumor agent for Fanconi patients (Montanuy, et al., 2020a and 2020b). Moreover, EGFR amplification has recently been observed in FA HNSCC (Webster et al., 2022). While our group is working to demonstrate the efficacy and safety of afatinib in Fanconi patients with HNSCC through a repositioning, multicenter, and international clinical trial, and considering that tumors often develop resistance to these therapies, limiting their long-term efficacy, our focus has been on identifying new therapeutic targets for afatinib-resistant FA HNSCC tumors. Considering that FA HNSCC lines exhibited 20-50 times less resistance to afatinib than sporadic lines (afatinib 20-45-80 nM vs. 800-1.000 nM), we attempted to establish the main differential mechanisms between sporadic and Fanconi lines, both resistant and non-resistant to afatinib. Although the low acquisition of resistance to afatinib in FA HNSCC lines supports the use of this inhibitor in clinical trials, the identification of potential therapeutic targets with differential expression in the obtained transcriptomic data opens the door to new strategies against HNSCC tumors in patients.