Radical Dendrimers Applications in Magnetic Resonance Imaging

Abstract

L'objectiu principal d'aquesta tesi és desenvolupar agents de contrast (CA) lliures de metalls per a imatge de ressonància magnètica (MRI) basats en radicals orgànics, com a solució al problema conegut de toxicitat associat amb els CA basats en Gd(III) (GBCA) àmpliament utilitzats en diagnòstics clínics. En particular, en agents basats en “dendrimers radicals”, és a dir, dendrímers completament funcionalitzats per radicals orgànics. En aquesta tesi s'explora la síntesi, caracterització i aplicació de nous dendrímers radicals, centrant-nos en i) millorar els mètodes sintètics anteriors, ii) investigar dendrímers radicals amfifílics capaços d'autoassemblar-se en estructures supramoleculars, i iii) incorporar propietats adicionals per desenvolupar sondes bimodals. Tots ells dissenyats per millorar la solubilitat en aigua, la capacitat de donar contrast, millorar la toxicitat i proporcionar característiques diagnòstiques multifuncionals. Els procediments sintètics previs de dendrímers radicals solubles en aigua eren complexos i consumien molt de temps. Per aquest motiu, el primer objectiu d’aquesta tesi ha estat el desenvolupament d’un procés de síntesi més eficient que impliqui menys passos de reacció i purificació que els obtinguts anteriorment. S'ha dissenyat, sintetitzat i caracteritzat una sèrie de dendrímers radicals solubles en aigua (G0 a G5) utilitzant una estratègia sintètica simplificada basada en un nucli de ciclotrifosfacè i unitats de ramificació derivades de lisina. Ha estat un mètode molt versàtil que permet modular la solubilitat en aigua dels compostos sota demanda i ha permès reduir substancialment el temps de reacció. Els estudis de ressonància paramagnètica electrònica (EPR) i dinàmica molecular (MD) revelen factors clau que influeixen en l'accessibilitat i la relaxativitat de l'aigua. La generació G5, amb 192 unitats de radical, mostra una relaxativitat molt alta (24 mM-1s-1) a causa de la seva gran densitat de radicals. Les proves in vitro i in vivo confirmen la seva biocompatibilitat i acumulació en tumors de glioblastoma. A més, l'àcid fòlic s'ha conjugat amb èxit a aquests dendrímers per a futures aplicacions adreçades a tumors. S'ha explorat l'ús de dendrons radicals amfifílics basats en una cadena de polietilenglicol (PEG) i dendrons bis-MPA completament funcionalitzats amb radicals nitroxil. És molt interessant el fet que els precursors dendrítics s'autoassemblen formant fibres, mentre que quan aquests incorporen els radicals s'organitzen formant nanovesícules (dendrimersomes) en les tres generacions estudiades (G2, G3 i G4). Les simulacions d'EPR, cryo-TEM i MD han permès estudiar-ne l'autoassemblatge i l'estructura. Aquests dendrímersomes demostren una relaxativitat comparable als GBCA i no mostren citotoxicitat. Estudis de biodistribució en ratolins in vivo van revelar que la generació més alta proporcionava temps d'obtenció d'imatges més llargs, superiors a una hora, juntament amb una bona biocompatibilitat i un bon contrast en teixits. S'excretava de manera eficient a través de l'orina. Aquestes noves nanovesícules obtingudes, a més de ser agents de contrast prometedors, també podrien utilitzar-se com a nanotransportadors de fàrmacs, compostos anticancerígens o material genètic, entre d'altres. Finalment, amb l'objectiu d'incorporar noves propietats als dendrímers radicals, s'ha desenvolupat un agent d'obtenció d'imatges bimodal, dissenyat per presentar no només propietats magnètiques sinó també fluorescents. Es basa en un dendrímer de poliamida que incorpora un nucli de naftalimida (Naft), funcionalitzat amb radicals nitroxil. Tot i que els radicals disminueixen parcialment la fluorescència, el compost final presenta tant capacitats d'imatge fluorescent com magnètica, cosa que el fa adequat per a la ressonància magnètica (MRI) i la imatge fluorescent en cèl·lules vives. A més, hem aconseguit explicar el procés de disminució de la fluorescència mitjançant càlculs de DFT. Aquest estudi destaca el potencial d’aquests agents per a la imatge de doble modalitat en el diagnòstic del càncer i el seguiment de la teràpia.

Resumen El objetivo principal de esta tesis es desarrollar agentes de contraste (CA) libres de metales para imagen de resonancia magnética (MRI) basados en radicales orgánicos, como solución al problema conocido de toxicidad asociado con los CA basados en Gd(III) (GBCA) ampliamente utilizados en diagnósticos clínicos. En particular, en agentes basados en “dendrímeros radicales”, es decir, dendrímeros completamente funcionalizados por radicales orgánicos. En esta tesis se explora la síntesis, caracterización y aplicación de nuevos dendrímeros radicales, centrándonos en i) mejorar los métodos sintéticos anteriores, ii) investigar dendrímeros radicales anfifílicos capaces de autoensamblarse en estructuras supramoleculares, e iii) incorporar propiedades adicionales para desarrollar sondas de imágenes bimodales. Todos ellos diseñados para mejorar la solubilidad en agua, la capacidad de dar contraste, mejorar la toxicidad y proporcionar características diagnósticas multifuncionales. Los procedimientos sintéticos previos de dendrímeros radicales solubles en agua eran complejos y consumían mucho tiempo. Por este motivo, el primer objetivo de esta tesis ha sido el desarrollo de un proceso de síntesis más eficiente que implique menos pasos de reacción y purificación que los obtenidos anteriormente. Se ha diseñado, sintetizado y caracterizado una serie de dendrímeros radicales solubles en agua (G0 a G5) utilizando una estrategia sintética simplificada basada en un núcleo de ciclotrifosfaceno y unidades de ramificación derivadas de lisina. Ha resultado ser un método muy versátil que permite modular la solubilidad en agua de los compuestos bajo demanda y ha permitido reducir sustancialmente el tiempo de reacción. Los estudios de resonancia paramagnética electrónica (EPR) y dinámica molecular (MD) revelan factores clave que influyen en la accesibilidad y relajatividad del agua. La generación G5, con 192 unidades de radical, muestra una relajatividad muy alta (24 mM-1s-1) debido a su gran densidad de radicales. Las pruebas in vitro e in vivo confirman su biocompatibilidad y acumulación en tumores de glioblastoma. Además, el ácido fólico se ha conjugado con éxito a estos dendrímeros para futuras aplicaciones dirigidas a tumores. Se ha explorado el uso de dendrones radicales anfifílicos basados en una cadena de polietilenglicol (PEG) y dendrones bis-MPA completamente funcionalizados con radicales nitroxilo. Es muy interesante el hecho que los precursores dendríticos se autoensamblan formando fibras, mientras que cuando éstos incorporan los radicales se organizan formando nanovesículas (dendrimersomas) en las tres generaciones estudiadas (G2, G3 y G4). Las simulaciones de EPR, cryo-TEM y MD han permitido estudiar su autoensamblaje y estructura. Estos dendrímersomas demuestran una relajatividad comparable a los GBCA y no muestran citotoxicidad. Estudios de biodistribución in vivo en ratones revelaron que la generación más alta proporcionaba tiempos de obtención de imágenes más largos, superiores a una hora, junto con una buena biocompatibilidad y un buen contraste en tejido. Se excretaba de forma eficiente a través de la orina. Estas nuevas nanovesículas obtenidas, además de ser agentes de contraste prometedores, también podrían utilizarse como nanotransportadores de fármacos, compuestos anticancerígenos o material genético, entre otros. Finalmente, con el objetivo de incorporar nuevas propiedades a los dendrímeros radicales, se ha desarrollado un agente de obtención de imágenes bimodal, diseñado para presentar no solo propiedades magnéticas sino también fluorescentes. Se basa en un dendrímero de poliamida que incorpora un núcleo de naftalimida (Naft), funcionalizado con radicales nitroxilo. Aunque los radicales disminuye parcialmente la fluorescencia, el compuesto final presenta tanto capacidades de imagen fluorescente como magnética, lo que lo hace adecuado para la resonancia magnética (MRI) y la imagen fluorescente en células vivas. Además, hemos logrado explicar el proceso de disminución de la fluorescencia mediante cálculos de DFT. Este estudio destaca el potencial de estos agentes para la imagen de doble modalidad en el diagnóstico del cáncer y el seguimiento de la terapia.

Summary The primary objective of this thesis is to develop metal-free contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI) based on organic radicals, addressing the well-known toxicity associated with the commonly used Gd(III)-based contrast agents (GBCAs) in clinical diagnostics. In particular, based on “radical dendrimers” i.e. dendrimers fully functionalized by organic radicals since dendrimers, which are monodisperse polymers with a precisely defined molecular structure, serve as an ideal platform for anchoring organic radicals. This strategy not only enhances relaxivity but also provides a shielding effect, protecting the radicals from reduction. This thesis explores the synthesis, characterization, and application of novel radical dendrimers, with a focus on i) improving previous synthetic methods, ii) investigating amphiphilic radical dendrimers capable of self-assembly into supramolecular structures, and iii) incorporating additional properties to develop bimodal imaging probes. All of them designed to enhance water-solubility, imaging capabilities, improve safety, and provide multifunctional (or multimodal) diagnostic features. Previous synthetic procedures of water-soluble radical dendrimers were complex and time-consuming. For this reason, the first aim of this thesis has been the development of a more efficient synthesis process involving fewer reaction and purification steps than those obtained in the group previously. It has been designed, synthesized and characterized a series of water-soluble radical dendrimers (G0 to G5 generations) using a simplified synthetic approach based on a cyclotriphosphazene core and lysine-derived branching units, functionalized with nitroxyl radicals. It has resulted in a highly versatile process that allows for on-demand modulation of water solubility and it has permitted to reduce substantially the reaction time. Electron paramagnetic resonance (EPR) and molecular dynamics (MD) studies reveal key factors influencing water accessibility and relaxivity. Higher-generation dendrimers, especially G5, with 192 radical units exhibit significantly enhanced relaxivity (24 mM-1s-1) due to increased radical density. In vitro and in vivo tests confirm their biocompatibility and accumulation in glioblastoma tumors. Additionally, folic acid has been successfully conjugated to these dendrimers for future tumor-targeted applications. It has been explored the use of amphiphilic radical dendrons based on a polyethylene glycol (PEG) chain and bis-MPA dendrons fully functionalized with nitroxyl radicals. Interestingly, while the dendritic precursors self-assemble forming fibres, upon the binding of radicals to them they organize forming nanovesicles (dendrimersomes) in the three generations studied (G2, G3, and G4). EPR, cryo-TEM, and MD simulations have made possible to track their self-assembly and structure. These dendrimersomes demonstrate relaxivity comparable to GBCAs and offer improved safety. In vivo biodistribution experiments in mice revealed that the highest generation provided extended imaging times exceeding one hour, along with good biocompatibility and enhanced tissue contrast. It accumulated in the bladder and was efficiently excreted through urine. These novel nanovesicles obtained, in addition to being promising contrast agents, could also be used as nanocarriers for drugs, anticancer compounds or genetic material, among others. Finally, with the aim of incorporating new properties to radical dendrimers, it has been developed a bimodal imaging agent, designed to exhibit not only magnetic but also fluorescent properties. It is based on a polyamide dendrimer incorporating a naphthalimide (Naft) core, functionalized with nitroxyl radicals. Although the fluorescence is partially quenched by the radicals, the final compound present both fluorescent and magnetic imaging capabilities, making it suitable for both MRI and live cell fluorescence imaging. In addition, we have been able to explain the fluorescence quenching process by means of DFT calculations. This study highlights the potential of such agents for dual-modality imaging in cancer diagnosis and therapy monitoring. In conclusion, this work demonstrates that multifunctional radical dendrimers are promising alternatives to GBCAs as MRI contrast agents.