Environmentally representative true-to- life nanoplastics as model test materials for human health risk evaluation

Abstract

Els micro i nanoplàstics (MNPLs) s'han convertit en un problema generalitzat en el medi ambient, plantejant possibles riscos per a la salut humana. Tanmateix, hi ha una important llacuna de coneixement per comprendre aquests riscos degut a la manca de materials realistes utilitzats en els estudis científics. La majoria de les investigacions s'han basat en plàstics pristins, com les micro i nano esferes de poliestirè, que difereixen considerablement dels nanoplàstics secundaris que es troben a la natura. Aquesta tesi aborda la necessitat de models ambientalment rellevants de MNPLs per millorar l'avaluació dels perills i riscos associats a la seva exposició.

L'objectiu principal d'aquest treball és desenvolupar i validar nanoplàstics realistes, generats a través de la degradació mecànica de materials plàstics més grans, com a models de nanoplàstics secundaris trobats en el medi ambient. Aquests materials imiten de manera propera aquells que es troben als ecosistemes naturals, fent-los més adequats per avaluar els impactes biològics, com l'absorció, distribució i toxicitat, proporcionant així una base per avaluacions de riscos més precises.

En aquest estudi es van plantejar tres objectius. El primer va ser crear un mètode fiable per produir micro i nanoplàstics a partir d'ampolles d'aigua de tereftalat de polietilè (PET), un dels contaminants més comuns. Els nanoplàstics generats van mostrar un rang de mides mes coherents amb mostres ambientals. Les proves inicials de toxicitat en cèl·lules humanes (THP1 i TK6) no van revelar dany a l'ADN, però hi va haver un augment notable però no significatiu en les espècies reactives d'oxigen (ROS), suggerint la necessitat d'estudiar més a fons els riscos de l'exposició a MNPLs de PET.

El segon objectiu va consistir en produir nanoplàstics de PET dopats amb titani (PET-Ti) a partir d'ampolles de llet opaques. El titani va servir com a marcador per rastrejar els nanoplàstics en sistemes biològics degut a la seva alta densitat electrònica, alhora que en conjunt aquesta partícula serveix com a model de co-contaminats o per a nanoplàstics complexos. Els nanoplàstics de PET-Ti es van produir amb èxit, mostrant una distribució consistent del titani en la matriu de PET, amb una variabilitat menor. Els estudis de toxicitat no van mostrar un impacte significatiu en la viabilitat cel·lular en cèl·lules hematopoètiques a concentracions subletals, confirmant la seva idoneïtat per a estudis biològics addicionals.

El tercer objectiu va ser crear un mètode simplificat i econòmic per marcar micro i nanoplàstics per al seu ús en estudis biològics. Es van provar diversos colorants, sent iDye PolyPink el més fiable per al marcatge nanoplàstics de PET. Les partícules etiquetades van conservar la seva estructura, fent-les fàcils de visualitzar en mostres biològiques a través de microscòpia confocal i amb las senyals fluorescents co-localizant amb els de titani, minimitzant les possibilitats de falsos positius.

En conclusió, aquesta tesi presenta un avenç significatiu en la generació de models de nanoplàstics realistes per a l'avaluació de riscos per a la salut. El treball estableix una base sòlida per a futurs estudis destinats a comprendre l'impacte biològic dels nanoplàstics, destacant la importància d'utilitzar materials realistes en les avaluacions toxicològiques

Los micro- y nanoplásticos (MNPLs) se han convertido en un problema generalizado y persistente en el medio ambiente, lo que plantea posibles riesgos para la salud humana. Sin embargo, existe una importante brecha en el conocimiento para comprender estos riesgos debido a la falta de materiales realistas para ser utilizados en estudios científicos, particularmente en los biológicos. La mayoría de las investigaciones se han basado en plásticos prístinos, como las nano o microesferas de poliestireno, que difieren considerablemente de los nanoplásticos secundarios que se encuentran en la naturaleza. Esta tesis aborda la necesidad de modelos ambientalmente relevantes de MNPLs para mejorar la evaluación de los peligros y riesgos asociados a su exposición.

El objetivo principal de este trabajo es desarrollar y validar nanoplásticos realistas, generados a través de la degradación mecánica de materiales plásticos más grandes, como modelos de nanoplásticos secundarios encontrados en el medio ambiente. Estos materiales imitan e mejor manera a los contam,inantes que se han de encontrar en los ecosistemas naturales, lo que los hace más adecuados para evaluar los impactos biológicos, como la absorción, distribución y toxicidad, proporcionando así una base para evaluaciones de riesgos más precisas.

En este estudio se plantearon tres objetivos. El primero fue crear un método confiable para producir micro y nanoplásticos a partir de botellas de agua de tereftalato de polietileno (PET), uno de los contaminantes más comunes. Los nanoplásticos generados mostraron un rango de tamaños mas coherentes lo que se espera encontrar en muestras ambientales. Las pruebas iniciales de toxicidad en células humanas (THP1 y TK6) no revelaron daño en el ADN, pero hubo un aumento que aunque no significativo si demuestra una tendencia al incremento en las especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que sugiere la necesidad de estudiar más a fondo los riesgos de la exposición a MNPLs de PET.

El segundo objetivo consistió en producir nanoplásticos de PET dopados con titanio (PET-Ti) a partir de botellas de leche de PET opaco. El titanio embebio ene stas matrices de PET sirvió como marcador para rastrear los nanoplásticos en sistemas biológicos debido a su alta densidad electrónica. Los nanoplásticos de PET-Ti se produjeron con éxito, mostrando una distribución consistente del titanio, con una variabilidad menor. Los estudios de toxicidad no mostraron un impacto significativo en la viabilidad celular en células hematopoyéticas a concentraciones subletales, lo que confirma su idoneidad para estudios biológicos adicionales.

El tercer objetivo fue crear un método simplificado y rentable para marcar micro y nanoplásticos para su uso en estudios biológicos. Se probaron varios colorantes como metodo de marcaje, siendo iDye PolyPink el más confiable para generar nanoplásticos de PET fluorescentes. Las partículas etiquetadas conservaron sus caracteristicas, lo que las hizo fáciles de visualizar en muestras biológicas a través de microscopía confocal, que en conjunto con las señales de Ti minimiza las posibilidades de falsos positivos.

En conclusión, esta tesis presenta un avance significativo en la generación de modelos de nanoplásticos realistas para la evaluación de riesgos para la salud. El trabajo establece una base sólida para futuros estudios destinados a comprender el impacto biológico de los nanoplásticos, destacando la importancia de utilizar materiales realistas en las evaluaciones toxicológicas.

Micro- and nanoplastics (MNPLs) have become a pervasive issue in the environment, posing potential risks to human health. However, there remains a significant knowledge gap in understanding these risks due to the lack of realistic materials used for scientific studies. Most research has relied on pristine, monomaterial plastics like polystyrene beads, which differ greatly from the secondary nanoplastics found in nature. This thesis addresses the need for environmentally relevant models of MNPLs to improve the assessment of hazards and risks associated with their exposure.

The primary aim of this work is to develop and validate true-to-life nanoplastics, created through the mechanical degradation of larger plastic materials, as models of environmentally relevant secondary nanoplastics. These materials closely mimic those found in natural ecosystems, making them more appropriate for assessing biological impacts, such as uptake, distribution, and toxicity, thus providing a foundation for more accurate risk assessments.

Three objectives were outlined in this study. The first was to create a reliable method for producing micro- and nanoplastics from polyethylene terephthalate (PET) water bottles, one of the most commonly found pollutants. The generated nanoplastics exhibited a range of sizes consistent with environmental samples. Initial toxicity tests on human cells (THP1 and TK6) revealed no DNA damage, but there was a notable increase in reactive oxygen species (ROS), suggesting the need for further study of PET MNPL exposure risks.

The second objective involved producing titanium-doped PET (PET-Ti) nanoplastics from opaque milk bottles. Titanium served as a marker for tracking the nanoplastics in biological systems due to its high electron density ath the same time serves as a model for co-contaminats or complex nanoplastics. PET-Ti nanoplastics were successfully produced, showing consistent titanium distribution, with minor variability. Toxicity studies showed no significant impact on cell viability in hematopoietic cells at sub-lethal concentrations, confirming their suitability for further biological studies.

The third objective was to create a simplified, cost-effective method for labeling micro- and nanoplastics for use in biological studies. A range of dyes was tested, with iDye PolyPink proving to be the most reliable for labeling PET nanoplastics. The labeled particles retained their characteristics, making them easy to visualize in biological samples through confocal microscopy along with the Ti signal co-localizing, thus minimizing the chances of false positives.

In conclusion, this thesis presents significant progress in generating realistic nanoplastic models for health risk assessment. The work sets a solid foundation for future studies aimed at understanding the biological impact of nanoplastics, highlighting the importance of using true-to-life materials in toxicological assessments.