Interactions and optical properties of microorganisms on surfaces

Abstract

(English) Controlling microbial growth is essential to industries such as healthcare, food, pharmacy but also for ship hulls and water systems. Interactions of bacteria with surfaces are highly dynamic and complex. Once a single cell transitions to a persistent multicellular microbial community (biofilm), elimination becomes complicated. Bacterial adherence, growth, and detachment are regulated by biological, chemical, physical, mechanical, and electrical properties of the bacterial cell, the surface, and the surrounding medium. Comprehensive studies in this field therefore require a multidisciplinary approach involving experts from different branches of science and appropriate choices of equipment depending on the question to address. This thesis focuses on the interaction and optical properties of bacteria on surfaces. More specifically, it investigates novel methods for enhanced bacteria detection, growth monitoring and presents an in-depth study of interaction mechanisms of bacteria and surface nano-structures. In the first part of the thesis, we validate a newly in-house built bio-sensing device to detect cells and their growth on surfaces. The proposed surface cytometer is compared with two standard laboratory methods, spectrophotometry and fluorescence microscopy. The results obtained with the three different techniques show similar trends, confirming the suitability of the surface cytometer as a compact, fast and low-cost device for measuring bacterial growth. Distinctively, the surface cytometer possesses both a large field-of view (~200 mm2) and depth of focus (~2 mm), these being particularly interesting for in-situ measurements and point-of-care testing. In order to enhance cell imaging, we propose a new type of surface, ultrathin (--10nm) gold films on a transparent substrate, such as glass. Such a surface has the capability to quench background fluorescence, improving microscopy and imaging. This is demonstrated through both numerical simulations and experiments. The physical mechanism at the basis of our design is that metals can reduce the lifetime of a fluorophore in its proximity. On the contrary, fluorophores further from the surface, because of their separation from the metal due to cell body, will maintain a much higher level of signal, i.e. they are less quenched. The higher signal-to-noise ratio (SNR) compared with a glass bare substrate is observed in both air and water. An improved SNR promotes the collection of a higher number of photons leading to more accurate localization precision, while reducing background, thanks to lower laser powers and shorter acquisition times. The enhanced imaging mediated through an ultrathin metal has potential in single-molecule localization super-resolution microscopy and live-cell imaging applications, especially under controlled conditions to minimize photodamage. In another study of the thesis, we demonstrate that bacterial growth can be regulated by tuning surface wettability. In contrast to commonly used indirect methods such as bacterial colony counting and scanning electron microscopy, we investigated a direct approach for assessment. First, we used molecular dynamics simulations to predict bacterial behavior on flat and nanostructured glass substrates, with wetting characteristics further modulated by chemical coatings. Then, we experimentally assessed these findings using E. coli bacteria and time-lapse fluorescence microscopy. Obtained data confirmed that nanostructured glass simultaneously hydrophobic, repelling water, and oleophilic, attracting fat, is most destructive, avoids cell adherence and promotes total cell disruption. These direct observations reflect a more accurate spatial- and time evolution of the interactions and bactericidal effects due to surface morphology and wettability. The results provide guidelines to design antimicrobial surfaces using simple nano-structuring and chemistry.

(Español) Controlar el crecimiento microbiano es esencial en industrias de salud, alimentación y, farmacia, también, en la superficie de los cascos de los barcos y en sistemas de tratamiento de agua. Interacciones entre bacterias y superficies son dinámicas y complejas. Cuando una célula se convierte en una colonia persistente (biopelícula), la eliminación se complica. Adherencia, crecimiento y desprendimiento de bacterias están regulados por propiedades biológicas, químicas, físicas, mecánicas y eléctricas de la célula bacteriana, la superficie y el medio. Investigaciones en este campo requieren un enfoque multidisciplinario involucrando a diferentes expertos científicos y elecciones adecuadas de equipos para el estudio. Esta tesis trata de la interacción y las propiedades ópticas entre bacterias y superficies. Concretamente, investiga métodos novedosos para mejorar la detección de bacterias, el seguimiento del crecimiento bacteriano y presenta un estudio en profundidad de los mecanismos de interacción entre bacterias y superficies nanoestructuradas. Validamos la tecnología del citómetro de superficie, dispositivo de detección biológica de reciente construcción para detectar células y su crecimiento en superficies. Éste, se compara con dos métodos de laboratorio estándar, espectrofotometría y microscopía de fluorescencia. Los resultados obtenidos mediante las tres técnicas muestran tendencias similares, confirmando la idoneidad del citómetro como dispositivo compacto, rápido y de bajo coste para la medición del crecimiento bacteriano. De manera distintiva, el citómetro posee gran campo de visión (~ 200 mm2) y elevada profundidad de enfoque (~ 2 mm), lo que es interesante para las mediciones in situ. Proponemos el empleo de un sustrato transparente, vidrio, con películas de oro ultrafinas (--10 nm), para mejorar la imagen celular. Esta superficie tiene la capacidad de apagar la fluorescencia de fondo, mejorando la microscopía y la formación de imágenes. Esto se expresa mediante simulaciones numéricas y experimentos. La base de nuestro diseño es que los metales pueden reducir la vida útil de un fluoróforo en sus proximidades. Sin embargo, los fluoróforos más alejados de la superficie, debido a su separación del metal del cuerpo celular, mantendrán un nivel de señal más alto (estarán menos apagados). La mayor relación señal-ruido (SNR) en comparación con un sustrato virgen de vidrio se observa tanto en aire como en agua. Una SNR mejorada promueve la recolección de un mayor número de fotones, conduciendo a una precisión de localización más precisa, al tiempo que se reduce el fondo, gracias a la menor potencia del láser y a los tiempos de adquisición más cortos. La obtención de imágenes mejoradas mediante un metal ultrafino muestra un potencial en aplicaciones de microscopía de superresolución de localización de una sola molécula y de imágenes de células vivas, especialmente en condiciones controladas para minimizar el fotodaño. Demostramos que el crecimiento bacteriano se puede regular ajustando la humectabilidad de superficie. A diferencia de los métodos indirectos comúnmente utilizados, recuento de colonias y la microscopía, investigamos un enfoque directo para la evaluación. Primero, utilizamos simulaciones moleculares dinámicas para predecir el comportamiento bacteriano en sustratos de vidrio nanoestructurados, con características de humectación moduladas por recubrimientos químicos. Luego, realizamos experimentos con E. coli y microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Los resultados confirmaron que el vidrio nanoestructurado hidrofóbico y oleofílico es el más destructivo, evitando la adherencia celular y promoviendo la rotura celular total. Esto refleja una evolución espacial y temporal más precisa de las interacciones y los efectos bactericidas debido a la morfología de superficie y humectabilidad. Además, proporcionan directrices para diseñar superficies antimicrobianas utilizando una simple nanoestructuración química.

(Català) El control del creixement microbià és essencial en les indústries de la salut, alimentació i farmàcia, però també en la superfície dels cascs dels vaixells i en els sistemes de tractament d’aigües. Les interaccions dels bacteris amb les superfícies són molt dinàmiques i complexes. Quan una sola cèl·lula es converteix en una comunitat microbiana multicel·lular persistent (biopel·lícula), la seva eliminació es torna complicada. L’adherència, el creixement i el despreniment dels bacteris està regulat per les propietats biològiques, químiques, físiques, mecàniques i elèctriques de la cèl·lula bacteriana, la superfície i el medi circumdant. Així doncs, els estudis integrals en aquest camp requereixen un enfocament multidisciplinari que involucri experts de diferents rames de la ciència i eleccions adequades d’equips en funció de la qüestió a abordar. Aquesta tesi se centra en la interacció i les propietats òptiques dels bacteris amb les superfícies. Més específicament, investiga nous mètodes per millorar la detecció de bacteris, el seguiment del creixement bacterià i presenta un estudi en profunditat dels mecanismes d’interacció entre bacteris i superfícies nanoestructurades. En la primera part d’aquesta tesi, validarem la tecnologia del citòmetre de superfície, un dispositiu de detecció biològica de recent construcció per a detectar cèl·lules i el seu creixement en superfícies. Aquest dispositiu proposat es compara amb dos mètodes de laboratori estàndard, espectrofotometria i microscòpia de fluorescència. Els resultats obtinguts a partir de les tres tècniques esmentades mostren tendències similars, confirmand la idoneïtat del citòmetre de superfície com a un dispositiu compacte, ràpid i de baix cost per a la mesura del creixement bacterià. De manera distintiva, el citòmetre de superfície posseeix un gran camp de visió (~200mm2) i una elevada profunditat d’enfocament (~2mm), els quals són particularment interessants per a les mesures in situ i les proves en el lloc d’atenció. En aquesta tesi proposem un nou tipus de superfície, pel·lícules d’or ultrafines (<10 nm) sobre un substrat transparent, com el vidre, per millorar la imatge cel·lular. Aquesta superfície té la capacitat d’apagar la fluorescència del fons, millorant la microscòpia i la formació d’imatges. Això s’expressa a partir de simulacions numèriques i experiments. El mecanisme físic de la base del nostre disseny és que els metalls poden reduir la vida útil d’un fluoròfor en la seva proximitat. Al contrari, els fluoròfors més allunyats de la superfície, donada la separació del metall del cos cel·lular, mantindran un nivell del senyal molt més alt, és a dir, hi seran menys apagats. La millor relació senyal-soroll (SNR, per les seves sigles en anglès) en comparació amb un substrat verge de vidre s’observa tant com en l’aire com en l’aigua. Una SNR millorada promou la recol·lecció d’un major nombre de fotons, el que condueix a una precisió de localització més precisa, al mateix temps que es redueix el fons, gràcies a la menor potència del làser i als temps d’adquisició més curts. L’obtenció d’imatges millorades a partir d’un metall ultrafí demostra un potencial en aplicacions de microscòpia de superresolució de localització d’una sola molècula i d’imatges de cèl·lules vives, especialment en condicions controlades per a minimitzar el fotodany. En un altre estudi de la tesi, demostrem que el creixement bacterià es pot regular ajustant la humectabilitat de la superfície. El contrast amb els mètodes indirectes comunament utilitzats, com el recompte de colònies bacterianes i la microscòpia electrònica de rastreig, investiguem un enfocament directe per a l’avaluació. Primer, utilitzem simulacions de dinàmica molecular per a predir el comportament bacterià en substrats de vidre plans i nanoestructurats, amb característiques d’humectació modulades a més de recobriments químics. Després avaluem experimentalment aquests resultats utilitzant bacteris, E. Coli, i microscòpia de fluorescència de lapse de temps. Les dades obtingudes confirmen que el vidre nanoestructurat simultàniament hidrofòbic, repel·leix l’aigua, i oleofilic, que atrau greixos, és el més destructiu, evitant l’adherència cel·lular i promovent la ruptura cel·lular total. Aquestes observacions directes demostren una evolució espacial i temporal més precisa que les interaccions i els efectes bactericides deguts a la morfologia de la superfície i la humectabilitat. Els resultats obtinguts proporcionen directrius per a dissenyar superfícies antimicrobianes utilitzant una simple nanoestructuració i química.