Targeted analysis for metabolomic studies in aquatic organisms

Abstract

En les darreres dècades, com a conseqüència del desenvolupament i creixement econòmic i social, els ecosistemes han patit canvis substancials. L’impacte antropogènic o l’empremta de l’activitat humana sobre els diferents ecosistemes té sovint conseqüències devastadores. Així doncs, resulta indispensable conèixer quins són els principals efectes i canvis que es produeixen en els sistemes metabòlics dels organismes vius. La metabolòmica estudia els canvis que es produeixen en els perfils de metabòlits d’un organisme, i per tant, dona informació sobre una visió global del que succeeix, estudiant les molècules més petites i la interacció entre elles. Més concretament, la metabolòmica ambiental, analitza els canvis que es produeixen en un organisme com a conseqüència de l’exposició a agents externs ambientals, és a dir, contaminants ambientals.

En aquest sentit, per poder analitzar els canvis en el perfil metabòlic, resulta indispensable disposar de tècniques analítiques capaces de determinar i caracteritzar amb suficient sensibilitat les molècules diana. La cromatografia, i especialment la cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses, suposa la millor opció en termes de sensibilitat, especificitat, i necessitat de preparativa de la mostra, entre d’altres. Aquesta tesi s’emmarca en el desenvolupament i optimització de tècniques d’extracció i anàlisi per avaluar canvis en el perfil metabòlic de dos organismes model (Daphnia magna i peix zebra) després de ser tractats amb contaminants ambientals com pesticides, fàrmacs o drogues d’abús.

En primer lloc, s’ha optimitzat els processos d’extracció i derivatització dels diferents metabòlits diana en els teixits analitzats (organisme sencer, cervell, i intestí) pels dos organismes model d’estudi mitjançant mètodes d’homogeneïtzació en fred per evitar la degradació de metabòlits. Pel que fa a les tècniques d’anàlisi, s’ha optimitzat les condicions cromatogràfiques i espectromètriques (basades en la cromatografia de líquids acoblada a espectrometria de masses en tàndem, UHPLC-MS/MS) per millorar la separació i la sensibilitat. Amb tot això, s’ha pogut avaluar els efectes que diferents contaminants ambientals (fàrmacs, pesticides, drogues, etc.) tenen sobre el comportament i el metabolisme. Els metabolits diana s’han escollit en cada estudi depenent de la característica de la matriu i l’efecte diana del contaminant. Per exemple, en estudis en que s’ha avaluat l’efcte de compostos de caràcter neuroactiu sobre teixit cerebral, s’ha determinat els canvis produits en els nivells de neurotransmissors. En canvi, en estudis en que s’ha analitzat teixit intestinal els metabolits diana han sigut neurotransmissors però també àcids grassos i lípids.

Pel que fa als resultats més destacats de Daphnia magna, aquesta tesi ha permès dilucidar que els dos clons provats mostren comportaments oposats, cosa que indica que l'assaig de comportament fototàctic es pot adaptar fàcilment a altres espècies. A més, els resultats van mostrar que els fàrmacs psicoestimulants en dosis farmacològiques augmenten les activitats de locomoció basal i les respostes a la llum, alhora que hi van disminuir l'habituació, i van millorar la producció d'espècies reactives d'oxigen d'una manera dependent de la concentració . En concentracions moderades, van augmentar la freqüència cardíaca, però en dosis altes, la van reduir. L'impacte en fins a 10 aminoàcids va indicar alteracions a la síntesi de neurotransmissors, el cicle de la urea, el metabolisme dels lípids i la funció cardíaca.

En la línia de recerca amb el peix zebra, s'ha comprovat que l'anàlisi de neurotransmissors a tot el cos de les larves no s'ha d'usar com a substitut general del cervell. A més, l'exposició al deprenil va inhibir completament l'activitat de la monoaminooxidasa, va augmentar els nivells de serotonina i dopamina i va regular els gens implicats en la síntesi i el transport de serotonina. Suggerint que les larves del peix zebra són molt sensibles i serveixen com un model vertebrat útil per estudiar canvis a curt termini en la senyalització de la serotonina. A més, tant la nicotina com la cotinina alteren diferents patrons en el comportament de les larves del peix zebra; els efectes similars de tots dos contaminants en aquest comportament s'alineen amb el concepte d'addició de concentració per a barreges binàries. Els estudis d'acoblament suggereixen que aquests efectes podrien estar intervinguts pel nAChR α7 del peix zebra a la retina. Com es va observar amb l'altre organisme model, l'exposició a la metamfetamina en peixos va resultar en una disminució dels nivells cerebrals de dopamina, norepinefrina i serotonina. Els canvis metabolòmics relacionats amb les alteracions del comportament proporcionen informació sobre els efectes bioquímics i conductuals de l'abús de metamfetamina, evitant els efectes de la hipotèrmia. A més, l'exposició al glifosat causa disbiosi intestinal al peix zebra, altera els nivells centrals i perifèrics de serotonina, eleva els nivells de dopamina al cervell i provoca canvis en l'ansietat i el comportament social. La disbiosi intestinal probablement es deu a les propietats antimicrobianes del glifosat. Els canvis observats en els nivells de neurotransmissors i la inducció d'estrès oxidatiu al cervell suggereixen que el glifosat altera l'eix microbiota-intestí-cervell, cosa que revela una manera d'acció nova i significativa.

Els resultats han demostrat la possibilitat d’avaluar el potencial risc que existeix en l’exposició a contaminants ambientals mitjançant tècniques analitiques. S’ha pogut comprobar com els diferents contaminants ambientals estudiats suposen una alteració en el perfil metabòlic i de comportament, evidenciant la necessitat de controlar i/o regular la presència de diferents substàncies en ecosistemes.

En las últimas décadas, como consecuencia del creciente desarrollo económico y social, los ecosistemas han sufrido cambios sustanciales. El impacto antropogénico o de la actividad humana sobre los diferentes ecosistemas tiene consecuencias devastadoras. Por tanto, es fundamental comprender los principales efectos que se producen en los sistemas metabólicos de los organismos vivos. La metabolómica estudia los cambios que se producen en los perfiles de los metabolitos de un organismo y, por tanto, da información sobre una visión global de lo que sucede en una especie al estudiar las moléculas más pequeñas y la interacción entre ellas. Más concretamente, la metabolómica ambiental, analiza los cambios del organismo como consecuencia de la exposición a agentes ambientales externos, es decir, contaminantes o estresantes ambientales.

En este sentido, para poder analizar los cambios en el perfil metabólico, es imprescindible disponer de técnicas analíticas capaces de determinar y caracterizar con suficiente sensibilidad las moléculas diana. La cromatografía, especialmente la cromatografía de líquidos acoblada a espectrometría de masas, proporciona una mayor sensibilidad, especificidad y menor necesidad de preparación de la matriz. Esta tesis doctoral se centra en el desarrollo y optimización de técnicas de extracción y análisis para evaluar el perfil metabólico de organismos modelo (Daphnia magna y pez cebra) mediante la exposción a contaminantes ambientales como pesticidas, productos farmacéuticos y drogas de abuso.

En primer lugar, se han optimizado los procesos de extracción y derivatización de los diferentes metabolitos en las distintas matrices de estudio (organismo entero, cerebro, intestino) utilizando métodos de homogeneización en frío para evitar la degradación de los metabolitos. Por lo que a las técnicas de análisis se refiere, se han optimizado las condiciones cromatográficas y espectrométricas (basadas en la cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem, UHPLC- MS/MS) para mejorar la separación y la sensibilidad. Con todo esto, se ha podido evaluar los efectos que diferentes contaminantes ambientales (fármacos, pesticidas, drogas de abuso, etc.) tienen sobre su comportamiento y metabolismo. Los metabolitos diana se han escogido en cada estudio dependiendo de las características de las matrices y del efecto diana del contaminante. Por ejemplo, en estudios desarrollados con compuestos de carácter neuroactivo en los que se ha evaluado la toxicidad cerebral, se determinó los cambios producidos en los niveles de neurotransmisores. Por otro lado, en estudios en los que se ha estudiado la toxicidad intestinal, los metabolitos diana han sido neurotransmisores, pero también ácidos grasos y lípidos.

En cuanto a los resultados más destacados de Daphnia magna, esta tesis ha permitido dilucidar que los dos clones probados mostraron comportamientos opuestos, lo que indica que el ensayo de comportamiento fototáctico se puede adaptar fácilmente a otras especies. Además, los resultados mostraron que los fármacos psicoestimulantes en dosis farmacológicas aumentaron las actividades de locomoción basal y las respuestas a la luz, al tiempo que disminuyeron la habituación a ella, y mejoraron la producción de especies reactivas de oxígeno de una manera dependiente de la concentración. En concentraciones moderadas, aumentaron la frecuencia cardíaca, pero en dosis altas, la redujeron. El impacto en hasta 10 aminoácidos indicó alteraciones en la síntesis de neurotransmisores, el ciclo de la urea, el metabolismo de los lípidos y la función cardíaca.

En la línea de investigación con el pez cebra, se ha comprovado que el análisis de neurotransmisores en todo el cuerpo de las larvas no debe usarse como un sustituto general del cerebro. Además, la exposición al deprenilo inhibió por completo la actividad de la monoaminooxidasa, aumentó los niveles de serotonina y dopamina y reguló los genes implicados en la síntesis y el transporte de serotonina. Sugiriendo que las larvas del pez cebra son muy sensibles y sirven como un modelo vertebrado útil para estudiar cambios a corto plazo en la señalización de la serotonina. Además, tanto la nicotina como la cotinina alteraron diferentes patrones en el comportamiento de las larvas del pez cebra; los efectos similares de ambos contaminantes en este comportamiento se alinean con el concepto de adición de concentración para mezclas binarias. Los estudios de acoplamiento sugieren que estos efectos podrían estar mediados por el nAChR α7 del pez cebra en la retina. Como se observó con el otro organismo modelo, la exposición a la metanfetamina en peces resultó en una disminución en los niveles cerebrales de dopamina, norepinefrina y serotonina. Los cambios metabolómicos relacionados con las alteraciones del comportamiento proporcionan información sobre los efectos bioquímicos y conductuales del abuso de metanfetamina, evitando los efectos de la hipotermia. Además, la exposición al glifosato causa disbiosis intestinal en el pez cebra, altera los niveles centrales y periféricos de serotonina, eleva los niveles de dopamina en el cerebro y provoca cambios en la ansiedad y el comportamiento social. La disbiosis intestinal probablemente se deba a las propiedades antimicrobianas del glifosato. Los cambios observados en los niveles de neurotransmisores y la inducción de estrés oxidativo en el cerebro sugieren que el glifosato altera el eje microbiota-intestino- cerebro, lo que revela un modo de acción novedoso y significativo.

Los resultados demuestran la posibilidad de evaluar el riesgo potencial que existe en la exposición a contaminantes ambientales mediante el uso de técnicas analíticas. De los resultados obtenidos, se puede concluir que la exposición a estos agentes suponen una alteración en el perfil metabólico y de comportamiento, revelando la necesidad de controlar y/o regular la presencia de diferentes sustancias en los ecosistemas.

In recent decades, as a result of the economic and social development and growth, ecosystems have undergone substantial changes. The anthropogenic impact or the imprint of human activity on different ecosystems often has devastating consequences. Therefore, it is essential to know what are the main effects and changes that occur in the metabolic systems of living organisms. Metabolomics studies alterations of the metabolite profiles of an organism, and therefore provides information on a global view of what is happening in an organism since it studies the smallest molecules and the interaction between them. More specifically, environmental metabolomics analyzes the changes that occur in an organism as a result of exposure to external environmental agents, i.e. environmental pollutants.

In this sense, to be able to analyze the changes in the metabolic profile, it is essential to have analytical techniques capable of determining and characterizing the target molecules with sufficient sensitivity. Chromatography, and especially liquid chromatography coupled to mass spectrometry, is the best option in terms of sensitivity, specificity, and the need for sample preparation, among others. This thesis is framed in the development and optimization of extraction and analysis techniques to evaluate changes in the metabolic profile of two model organisms (Daphnia magna and zebrafish) after being treated with environmental pollutants such as pesticides, pharmaceuticals or drugs of abuse.

First, the extraction and derivatization processes of the different target metabolites in the tissues analyzed (whole organism, brain, and intestine) for the two study model organisms have been optimized using cold homogenization methods to avoid degradation of metabolites. Regarding the analysis techniques, the chromatographic and spectrometric conditions (liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS) have been optimized to improve separation and sensitivity. With all this, it has been possible to evaluate the effects that different environmental pollutants (medicines, pesticides, drugs, etc.) have on behavior and metabolism. The target metabolites were chosen in each study depending on the characteristics of the matrix and the target effect of the contaminant. For example, in studies in which the effect of neuroactive compounds on brain tissue has been assessed, the changes produced in the levels of neurotransmitters have been determined. On the other hand, in studies in which intestinal tissue has been analyzed, the target metabolites have been neurotransmitters but also fatty acids and lipids.

As for the most outstanding results specific to Daphnia magna, this thesis has allowed to elucidate that the two tested clones showed opposite behaviors in both vertical and horizontal setups, indicating that the phototactic behavior assay can be easily adapted to other species. Furthermore, the results shown that psychostimulant drugs at pharmacological doses increased basal locomotion activities and responses to light, while decreasing habituation to it, and enhanced the production of reactive oxygen species in a concentration-dependent manner. At moderate concentrations, they increased heart rates, but at high doses, they reduced them. The impact on up to 10 amino acids indicated disruptions in neurotransmitter synthesis, the urea cycle, lipid metabolism, and cardiac function.

In the research line of this study involving zebrafish, the main contributions of this thesis highlight that the analysis of neurotransmitters in the zebrafish larvae whole-body should not be used as a general surrogate of the brain. Moreover, deprenyl exposure completely inhibited monoamine oxidase activity, dramatically increased levels of serotonin and dopamine, and downregulated genes involved in serotonin synthesis and transport. These findings suggest that zebrafish larvae are highly sensitive and serve as a useful vertebrate model for studying short-term changes in serotonin signaling. Besides, both nicotine and cotinine consistently altered different patterns in zebrafish larvae behavior, similar effects of both pollutants on this behavior align with the concentration addition concept for binary mixtures. Docking studies suggest that these effects could be mediated by the zebrafish α7 nAChR in the retina. As observed with the other tested model organism, methamphetamine exposure in fish resulted in a decrease in brain levels of dopamine, norepinephrine, and serotonin. Metabolomic changes linked with the behavioral alterations provide insights into the biochemical and behavioral effects of methamphetamine abuse, avoiding the hypothermia effects. Furthermore, our findings show that glyphosate exposure causes gut dysbiosis in zebrafish, alters central and peripheral serotonin levels, raises brain dopamine levels, and leads to changes in anxiety and social behavior. The gut dysbiosis is likely due to glyphosate's antimicrobial properties. The observed changes in neurotransmitter levels and induction of oxidative stress in the brain suggest that glyphosate impairs the microbiome-gut-brain axis, revealing a novel and significant mode of action.

Thus, the results have demonstrated the possibility of assessing the potential risk due to the exposure to environmental pollutants or pharmacology doses using analytical techniques and two perfectly suitable aquatic model organisms. It has been possible to verify how the different stressors produced an alteration in the metabolic and behavioral profile, evidencing the need to control and/or regulate the presence of different substances in ecosystems