Molecular Mechanisms of the Ubiquitin Ligase HERC2 in Cell Signalling: Implications in Cellular Stress, Autophagy and Proteasome Assembly

Abstract

[eng] Ubiquitylation is a posttranslational modification that consists in the attachment of ubiquitin to a substrate protein. During the process of ubiquitylation, the E3 ubiquitin ligases determine the specificity of the substrates, thus, they represent a crucial regulatory factor. Among them is the ubiquitin ligase HERC2, which belongs to the Large HERC protein family. HERC2 has been extensively studied for its implication in the regulation of genomic stability and p53 transcriptional activity. However, its involvement in other signalling pathways in which ubiquitylation also plays an important role remains fairly unexplored. Regarding the clinical relevance of HERC2, mutations in HERC2 gene in humans have been related to different pathologies such as a neurodevelopmental disorder known as HERC2 Angelman-like syndrome and several types of cancers. A better understanding of how pathologic HERC2 mutant variants affect intracellular signalling may aid definition of potential new therapies for these disorders. In view of all this, the main objective of this thesis was to study the signalling pathways regulated by HERC2 and to characterize the molecular mechanisms behind. We focused on the MAPK and autophagy pathways, and analysed how these are deregulated in pathological contexts of HERC2 deficiency. For that, we studied patient-derived fibroblasts of individuals with the HERC2 Angelman-like syndrome, which present a marked reduction in HERC2 protein levels. We complemented the investigations using other human and mouse cellular models by knocking down HERC2 protein expression. On the other hand, we applied a proteomic approach to identify ubiquitylated proteins regulated by HERC2, which can help to unveil novel physiological functions of this ubiquitin ligase. First, we studied MAPK signalling pathways in the patient-derived fibroblasts and observed increased levels of C-RAF protein and p38 phosphorylation. We showed that this occurs due to the fact that HERC2 regulates ubiquitin-mediated proteasomal degradation of C-RAF. Thus, in a context of HERC2 deficiency, C-RAF protein levels are upregulated. We found out that this upregulation triggers overactivation of a crosstalk between C-RAF and MKK3/p38 signalling pathways, which boosts the cellular response to oxidative stress through NRF2 and the expression of antioxidant genes.

Secondly, we focused on autophagy and observed that it was increased in HERC2 deficient cells. Moreover, we demonstrated that HERC2 regulates protein levels of the autophagy initiating kinase ULK1 and the deubiquitinating enzyme USP20, which stabilizes ULK1. Additionally, we showed that HERC2 interacts with USP20, and observed that this interaction is disrupted upon p38 phosphorylation. Taken together these results suggested that HERC2 regulates autophagy through modulating USP20/ULK1 axis and that this process might be fine-tuned by p38 activity. In third place, we applied a proteomic approach to identify potential HERC2 ubiquitylation substrates. Results showed a functional enrichment of proteins related with the proteasome assembly pathway such as PSMC5 and PAAF1. We further confirmed that HERC2 interacts with these proteins in pull-down experiments. Finally, we discussed the molecular mechanisms of HERC2 in the regulation of MAPK signalling, autophagy and the proteasome assembly pathway, trying to postulate a working model that adds the results obtained to the knowledge stablished so far in the scientific literature. In addition, we inquired about how these mechanisms fit with the pathophysiology of the HERC2 Angelman-like syndrome and cancer. In conclusion, throughout this work we revealed previously unexplored functions of the ubiquitin ligase HERC2 in cell signalling. In particular, we described HERC2 as a regulator of: 1) the cellular response to oxidative stress through the C-RAF/MKK3/p38 pathway; 2) autophagy through the USP20/ULK1 axis; and 3) the proteasome assembly pathway through regulating ubiquitylation of proteins such as PSMC5 and PAAF1.

[cat] La ubiqüitilació és una modificació post-traduccional que consisteix en la unió d’una o més molècules d’ubiqüitina a una proteïna substrat. Durant el procés d’ubiqüitilació, les lligasses d’ubiqüitina E3 determinen l’especificitat dels substrats. Per aquesta raó, representen un factor regulador molt important. Una d’aquestes és la ubiqüitina lligassa HERC2, que pertany a la família de proteïnes anomenades “HERC grans”. La proteïna HERC2 ha estat àmpliament estudiada per la seva implicació en la regulació de l'estabilitat genòmica i l'activitat transcripcional de p53. Tanmateix, la seva participació en altres vies de senyalització, en què la ubiqüitilació també hi té un paper regulador important, continua sent força desconeguda. Pel que fa a la rellevància clínica de l’HERC2, mutacions en el seu gen en humans s’han relacionat amb diferents patologies com ara amb un trastorn del neuro- desenvolupament similar a la síndrome d’Angelman que s’anomena “HERC2 Angelman-like”, i també amb diversos tipus de càncers. Un millor coneixement de com les diferents mutacions patològiques del gen HERC2 afecten a la senyalització intracel·lular ens pot ajudar a desenvolupar possibles noves teràpies per a les persones afectades per aquests trastorns. Tenint en compte tot això, l’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral va ser estudiar les vies de senyalització regulades per la proteïna HERC2 i caracteritzar-ne els mecanismes moleculars. Concretament, ens vam centrar en les vies de les MAPK i la via de l’autofàgia, analitzant també com aquestes es desregulen en contextos patològics de deficiència d’HERC2. Per assolir aquests objectius, vam estudiar fibroblasts humans derivats de pacients amb la síndrome HERC2 Angelman-like, els quals presenten una marcada reducció dels nivells de la proteïna HERC2. A més a més, vam complementar aquestes investigacions utilitzant altres models cel·lulars com ara cèl·lules humanes i de ratolí amb un silenciament de l’expressió de la proteïna HERC2. Per altra banda, també vam realitzar un estudi de proteòmica per identificar proteïnes ubiqüitilades que estiguin regulades per l’HERC2. Aquest enfocament ens pot ser molt útil per tal de descobrir noves funcions fisiològiques d’aquesta ubiqüitina lligassa. Així doncs, primer vam estudiar les vies de senyalització de les MAPK en els fibroblasts derivats del pacient amb la síndrome HERC2 Angelman-like i vam observar que presentava uns nivells augmentats de la proteïna C-RAF, així com també de la fosforilació de p38.

Seguidament, vam demostrar que això es produeix perquè l’HERC2 regula la ubiqüitilació i posterior degradació via proteasoma de C-RAF. Així doncs, en un context de deficiència d’HERC2, els nivells de proteïna de C-RAF incrementen. A més a més, vam descobrir que aquest increment provoca la sobre-activació d’una comunicació entre les vies de senyalització de C-RAF i MKK3/p38, cosa que dispara la resposta cel·lular a l’estrès oxidatiu mitjançant el factor de transcripció NRF2 i l’expressió de gens antioxidants. En segon lloc, ens vam centrar en la via de l’autofàgia i vam observar que aquesta està incrementada en les cèl·lules deficients d’HERC2. A més, vam demostrar que l’HERC2 regula els nivells de la cinasa iniciadora de l’autofàgia ULK1 i de l’enzim deubiqüitinant USP20, el qual pot estabilitzar ULK1. També, vam descobrir que l’HERC2 interacciona amb l’USP20 i vam observar que aquesta interacció es veu alterada per l’activació de p38. En conjunt, aquests resultats van suggerir-nos que l’HERC2 regula l’autofàgia mitjançant la modulació de l’eix USP20/ULK1 i que aquest procés pot estar ajustat per mitjà de l’activitat de p38. A continuació, vam realitzar un estudi de proteòmica per identificar els possibles substrats d’ubiqüitilació de l’HERC2. Els resultats van mostrar-nos un enriquiment funcional de proteïnes relacionades amb la via del muntatge del proteasoma com ara PSMC5 i PAAF1. Seguidament, vam confirmar que l’HERC2 interacciona amb aquestes proteïnes amb uns experiments d’interacció. Finalment, a l’apartat de discussió, plantegem quins són els mecanismes moleculars a través dels quals l’HERC2 regula les vies de les MAPK, l’autofàgia i la del muntatge del proteasoma, intentant postular un model que encaixi els resultats que hem obtingut amb el coneixement científic previ. A més a més, també debatem sobre com aquests mecanismes es poden relacionar amb la fisiopatologia de la síndrome HERC2 Angelman-like i el càncer. En conjunt, durant aquest treball hem revelat funcions prèviament inexplorades de la lligasa d’ubiqüitina HERC2 en la senyalització cel·lular. En concret, hem descrit a l’HERC2 com a reguladora de diversos processos com ara: 1) la resposta cel·lular a l’estrès oxidatiu, a través de la via C-RAF/MKK3/P38. 2) L’autofàgia, a través de l’eix USP20/ULK1. 3) La via de muntatge del proteasoma, mitjançant la regulació de la ubiqüitilació de proteïnes com ara PSMC5 i PAAF1.