Modulación de genes y miRNAs desregulados en la enfermedad inflamatoria intestinal por vesiculas extracelulares de probióticos y microbiota comensal

Abstract

[spa] La microbiota intestinal es importante para desarrollo del sistema inmunológico y la modulación de la barrera epitelial intestinal. La disbiosis, un desequilibrio en la microbiota, altera la homeostasis intestinal y contribuye a enfermedades como la EII. La composición de la microbiota está influenciada por el perfil genético del huésped, y ciertos polimorfismos se han asociado con la EII. Una respuesta inmunitaria desregulada del huésped a la microbiota agrava esta patología. En consecuencia, se han desarrollado diversas estrategias terapéuticas orientadas al microbioma para restaurar la homeostasis intestinal en estos pacientes. En particular, los postbióticos, especialmente las vesículas extracelulares (EVs) derivadas de cepas probióticas, emergen como tratamientos prometedores para la EII. En este contexto, nuestro grupo de investigación ha demostrado propiedades beneficiosas de las EVs derivadas de bacterias intestinales, especialmente del probiótico E. coli Nissle 1917 (EcN) y la cepa comensal EcoR12. Sin embargo, se requieren más investigaciones para comprender el papel de los postbióticos, en particular las EVs de probióticos, en el tratamiento de la EII. Por lo tanto, objetivo principal de esta tesis fue evaluar los mecanismos moleculares que subyacen al efecto de las EVs de probióticos y microbiota en la modulación de genes y miRNAs desregulados en la EII. En primer lugar, evaluamos los mecanismos moleculares implicados en la modulación de la integridad y reparación de la barrera intestinal por EVs de la microbiota mediante la regulación diferencial de miR-7-5p y su diana TFF3, ambos desregulados en EII (Capítulo 1). Empleamos un modelo in vitro de células LS174T estimuladas con EVs de la microbiota, evaluando la expresión de genes y miR-7-5p mediante RT-qPCR e inhibidores de TLR2 o PI3K. Posteriormente evaluamos el impacto en la función de la barrera epitelial usando medios condicionados de LS174T para tratar monocapas de Caco-2, analizando la expresión y distribución de proteínas de unión estrecha y mediante ensayos de curación de heridas. Los resultados mostraron una regulación diferencial de TFF3 en LS174T mediante EVs de EcN y EcoR12. Las EVs de EcN activaron la producción de TFF3 mediante TLR2 y regularon negativamente miR7-5-p mediante la vía de señalización PI3K. En consecuencia, el TFF3 secretado en respuesta a las EVs de EcN promovió el refuerzo de la barrera epitelial y la curación de heridas. Las EVs de EcoR12 no desencadenaron estos efectos.

A continuación, nos centramos en genes y miRNAs del sistema serotoninérgico, un mediador clave de la función intestinal. La serotonina modula el sistema nervioso entérico, respuestas inmunes, inflamación, motilidad intestinal e integridad de la barrera. Utilizamos un modelo in vitro de células Caco-2 tratadas con IL-1β para inducir inflamación y evaluamos el impacto de las EVs de EcN y EcoR12 en la modulación de genes serotoninérgicos (Capítulo 2). Los efectos se evaluaron con RT-qPCR, ELISA y microscopía confocal de inmunofluorescencia, cuantificando citocinas proinflamatorias, enzimas de estrés oxidativo, así como las alteraciones inducidas por IL-1β en las uniones estrechas epiteliales y la regulación postranscripcional de SERT por miR-24 y miR-200a. Los resultados muestran que las EVs de EcN atenúan las alteraciones inducidas por IL-1β, afectando el metabolismo de la serotonina, el estrés oxidativo y la integridad de la barrera epitelial. Además, regulan SERT, miR-200a y miR-24, sugiriendo su potencial como postbiótico en la EII. Finalmente, evaluamos si las EVs de las cepas en estudio pueden contrarrestar o prevenir la expresión alterada del transportador PepT1 en condiciones inflamatorias mediante la regulación de miR-92b y miR-193a-3p, importantes para la homeostasis intestinal (Capítulo 3). Analizamos la regulación de PepT1 por EVs en células Caco-2 en un modelo de inflamación inducida por IL-1β. Evaluamos los niveles relativos de mRNA, miRNAs reguladores con RT-qPCR, y la proteina mediante ELISA y microscopía confocal. También evaluamos el impacto de EVs de EcN y EcoR12 en la expresión de PepT1 inducida por Tri-DAP. La regulación positiva de miR-193a-3p por EVs de EcN contribuye a la mejora de la inflamación intestinal y la restauración de la homeostasis mediante la regulación positiva de miR-193a-3p que desencadena la inhibición de PepT1. En conclusión, las EVs de la cepa probiótica EcN muestran un potencial significativo como postbiótico en el tratamiento de la EII.

[eng] The gut microbiota is essential for gastrointestinal physiology, immune system development, and barrier maintenance. Imbalances, or dysbiosis, disrupt intestinal homeostasis and contribute to diseases like IBD. Influenced by genetic factors, a dysregulated immune response to microbiota affects IBD. Nutritional and therapeutic strategies aim to restore balance and promote anti-inflammatory profiles. In this context, postbiotics are emerging as a novel IBD treatment strategy. Extracellular vesicles (EVs) from probiotics and gut microbiota strains show promise as postbiotics, with research indicating that EVs mediate microbiota functions by delivering effector molecules to host cells. These bacterial molecules modulate signaling pathways, immune responses, and other cellular processes. Our research shows the benefits of microbiota-derived EVs, focusing on Escherichia coli strains EcN and EcoR12. Despite progress, further research is needed to understand postbiotics' role in IBD treatment. The main objective of this thesis was to evaluate the molecular mechanisms underlying the effects of probiotic and microbiota derived EVs on the modulation of dysregulated genes and miRNAs in IBD. In Chapter 1, we studied the molecular mechanisms by which microbiota-derived EVs modulate intestinal barrier integrity and repair, focusing on dysregulated miR-7-5p and its target gene TFF3 in IBD. Using LS174T goblet cells, we found that EcN EVs activated TFF3 production via TLR2 and reduced miR-7-5p via PI3K, enhancing tight junctions and promoting wound healing in Caco-2 cells. EcoR12 EVs did not show these effects. This study demonstrates the differential regulation of TFF3 by microbiota EVs and suggests TFF3 as a potential therapeutic target in treating IBD. In Chapter 2, we investigated the impact of EVs from EcN and EcoR12 on genes related to the serotonergic system using an IL-1β-induced inflammatory model with Caco-2 cells. Serotonin (5-HT) is crucial for intestinal function, immune responses, and barrier integrity, which are dysregulated in IBD. EcN EVs attenuated IL-1β-induced alterations, influencing serotonin metabolism and barrier integrity through SERT, miR- 200a, and miR-24 regulation. These findings suggest EcN EVs as potential postbiotic treatments for IBD. In Chapter 3, we sought to evaluate whether EVs isolated from the probiotic EcN and the commensal EcoR12 could counteract/prevent altered PepT1 expression under inflammatory conditions through the regulation of miR92b and miR-193a-3p. These miRNAs are crucial for regulating colonic PepT1 and maintaining intestinal homeostasis. Using an IL-1β-induced inflammation model in Caco-2 cells. We also studied the influence of microbiota EVs on PepT1 expression under Tri-DAP induction to understand their regulatory mechanisms in physiological and pathological conditions. This study demonstrates that EcN EVs improve inflammation by upregulating miR-193a-3p and subsequently downregulating PepT1 protein levels in intestinal epithelial cells. In conclusion, the data presented in this thesis indicate that EVs derived from the probiotic EcN have significant potential as a postbiotic treatment for IBD due to their ability to restore intestinal homeostasis at multiple levels.