Study of new strategies for steatotic liver disease: SIRT1-mediated modulation of VLDLR levels and evaluation of a soluble epoxyde hydrolase-targeted PROTAC

Abstract

[eng] Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) is the most common cause of chronic liver disease (CLD). The first stage in the development of MASLD is metabolic dysfunction-associated fatty liver (MASL), which is defined as a condition where excessive levels of triglycerides (TG) accumulate in the liver. Little is known about the role played by the uptake of lipoproteins, such as very low-density lipoproteins (VLDL) that predominantly transport TG in plasma, in the development of hepatic steatosis. Interestingly, endoplasmic reticulum (ER) stress-mediated increase in the levels of the VLDL receptor (VLDLR) results in remarkable hepatic steatosis via enhanced triglyceride-rich lipoprotein delivery to the liver. A better understanding of how hepatic VLDLR is regulated might help to develop new effective therapies against MASLD. On the other hand, soluble epoxide hydrolase (sEH), an enzyme highly expressed in the liver, converts epoxyeicosatrienoic acids (EETs) and other epoxy fatty acids (EpFAs) to their corresponding diols. These diols are much less bioactive than their parents’ epoxides. As a result, compounds that inhibit sEH increase the levels of EETs and other EpFAs, which are opposing counterparts to the largely pro-inflammatory prostanoids and leukotrienes, thereby providing therapeutic efficacy for the treatment of several diseases, including hepatic steatosis. An additional new strategy for targeting sEH might be the use of proteolysis-targeting chimeras (PROTACs), due to its capacity to induce its degradation. In the present thesis, we show that induction of hepatic steatosis by fructose-drinking water in rats caused a reduction in the levels of hepatic sirtuin 1 (SIRT1), a NAD (+)-dependent deacetylase, and upregulation of VLDLR, suggesting a potential relationship between these two proteins. Consistent with this, Sirt1-/- mice displayed increased hepatic VLDLR levels and enhanced expression of HIF-1α-target genes. Likewise, the increase in VLDLR protein levels induced by pharmacological inhibition or gene knockdown of SIRT1 in a human hepatic cell line was abolished by a HIF-1α inhibitor. Moreover, SIRT1 activation in mice prevented the increase in hepatic VLDLR protein levels caused by ER stress. Additionally, we report that the sEH-targeting PROTAC ALT-PG2 degrades this protein in the human hepatoma-derived Huh-7 cell line and in primary mouse hepatocytes as well as in the liver of mice. PROTAC-mediated degradation of the sEH protein in cells resulted in adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activation, while phosphorylated extracellular-signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) was reduced. Consistent with the role of these two kinases in ER stress, ALT-PG2 reduced both ER stress and inflammatory markers. Altogether, the findings of the present doctoral thesis shed light on a new mechanism of VLDLR regulation and its contribution to hepatic steatosis and demonstrate that targeting sEH with a PROTAC molecule is an effective strategy to activate AMPK and to prevent ER stress and inflammation in hepatic cells.

[spa] La causa más común de enfermedad crónica del hígado (CLD) es la enfermedad del hígado graso asociada a disfunción metabólica (MASLD, por sus siglas en inglés). El hígado graso asociado a la disfunción metabólica (MASL, por sus siglas en inglés), que se define como una condición donde se acumulan niveles excesivos de triglicéridos (TG) en el hígado, es la primera etapa en el desarrollo de MASLD. La captación de lipoproteínas, como las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), que transportan principalmente TG en el plasma, es poco conocida por su papel en el desarrollo de la esteatosis hepática. Es destacable que el aumento de los niveles del receptor de VLDL (VLDLR) mediado por el estrés del retículo endoplásmico (ER) contribuye significativamente a la esteatosis hepática a través de un aumento en la captación de lipoproteínas ricas en triglicéridos por el hígado. Entender mejor cómo se regulan los niveles de VLDLR hepático podría ayudar en el desarrollo de nuevas terapias contra el MASLD. Por otro lado, la epóxido hidrolasa (sEH de su acrónimo en inglés soluble epoxide hydrolase), una enzima que se expresa de forma abundante en el hígado convierte ácidos eicosatrienoicos epóxicos (EETs epoxyeicosatrienoic acids y epoxiácidos (EpFA, epoxy fatty acids) en sus correspondientes dioles. Estos dioles son menos bioactivos que sus precursores epóxidos. El resultado de la inhibición de la sEH es un aumento de los niveles de EETs y otros EpFAs, que son antagónicos de prostanoides y leucotrienos proinflamatorios. El aumento de estos compuestos proporciona eficacia terapéutica para el tratamiento de varias enfermedades, incluida la esteatosis hepática. Debido a su capacidad para inducir su degradación, las quimeras de direccionamiento de proteólisis (PROTACs , proteolysis targeting chimeras) podrían ser una nueva estrategia para degradar la sEH. En esta tesis demostramos que el consumo de fructosa en ratas causó esteatosis hepática, reduciendo los niveles de sirtuina 1 hepática (SIRT1), una deacetilasa dependiente de NAD y aumentando los de VLDLR, lo que sugería una relación potencial entre estas dos proteínas. De hecho, los ratones deficientes en SIRT1 presentaban niveles más altos de VLDLR hepático y mayor expresión de los genes diana de HIFHIF--11α. Asimismo, el aumento de los niveles de VLDLR inducidos mediante inhibición farmacológica o la inactivación del gen de SIRT1 en una línea celular hepática humana se contrarrestó con un inhibidor HIFHIF--11α.. Además, la activación de SIRT1 en ratones impidió el aumento de los niveles de proteína VLDLR hepático provocado por el estrés del ER. Adicionalmente, demostramos que demostramos que un PROTAC dirigido contra la sEH, ALTa sEH, ALT--PG2, degrada esta proteína en hepatocitos primarios de ratón, en la línea celular de hepatoma humano Huh7 así como en hígado de ratón. La degradación de la sEH causada por el PROTAC en células activó la proteína quinasa activada por monofosfato de adenosina (AMPK), mientras que los niveles de la quinasa regulada por monofosfato de adenosina (AMPK), mientras que los niveles de la quinasa regulada por señales extracelulares 1/2 (ERK1/2) disminuyeron.. En consonancia con el papel que estas dos quinasas desempeñan en el estrés del RE, ALT, ALT--PG2 PG2 disminuyó tanto los niveles de marcadores de estrés del RE como inflamatorios. Los resultados generales de la tesis doctoral desvelan un nuevo mecanismo de regulación de VLDLR y su papel en la esteatosis hepática, y asimismo demuestran que la degradación de la de la proteína sEH con una molécula PROTAC es un método efectivo para activar AMPK y prevenir el estrés y la inflamación el estrés en las células hepáticas.