Development of new indications for SNF472 in the treatment of vascular calcification-related diseases

Abstract

[eng] Peripheral Artery Disease (PAD) is a chronic vascular condition characterized by the narrowing or obstruction of arteries, primarily in the lower limbs, leading to ischemic complications. Unlike atheromatous PAD, where lipid-rich plaques obstruct blood flow, exists a distinct and more severe subtype, defined as calcific PAD. Calcific PAD is driven by calcification in the medial arterial layer, reducing vascular compliance and causing severe ischemia and a worse clinical profile. Calcific PAD progresses rapidly, resulting in intense pain, reduced mobility, non-healing wounds, and a higher risk of amputation, and mortality than traditional PAD. This condition is particularly prevalent in high-risk populations, including individuals with chronic kidney disease (CKD), due to underlying vascular and metabolic dysfunctions, systemic mineral imbalances, and chronic inflammation. Standard PAD therapies are largely ineffective against MAC due to its non-obstructive nature. As a result, calcific PAD patients face limited treatment options and poorer outcomes. Despite the severe clinical implications, focused research dedicated to understanding and treating this condition remains insufficient and affected patients are frequently excluded from major clinical trials. This issue is further compounded by the absence of preclinical models that accurately replicate the pathophysiology of calcific PAD, making it difficult to explore the underlying mechanisms or test potential therapies. Addressing these gaps in research and treatment is essential to improve outcomes for this vulnerable patient population. This thesis aims to establish an effective preclinical model of PAD driven by cardiovascular calcification (CVC). The primary objective is to replicate key disease features, such as lower limb ischemia status and impaired locomotor function, both induced by ectopic calcification in rats. Additionally, the study evaluates cilostazol, a standard treatment for atherosclerotic PAD, alongside SNF472, an inhibitor of calcification, to compare their therapeutic effects on key disease parameters. Our research involved determining the optimal dosage and induction period of vitamin D3 to achieve a calcification degree capable of simulating the pathological state of the disease. Advanced imaging techniques (histology, micro-computed tomography (µ–CT), and scanning electron microscopy (SEM), were employed for a comprehensive characterization of induced CVC. The thesis encompasses four in vivo trials to establish a robust and reproducible methodology. Ischemic severity was quantified using Laser Speckle Contrast Imaging (LSCI), while treadmill tests were used to evaluate locomotor capacity. Total tissue calcification was assessed through calcium quantification via Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES), supplemented by the analysis of relevant blood biomarkers. Two efficacy studies and one progression study were conducted to compare the therapeutic effects of cilostazol and SNF472, along with an additional study examining the dose-response and administration regimens for SNF472. We have successfully developed a rat model that accurately replicates the pathological condition of the calcific PAD in humans. In this model, we verified the lack of efficacy of cilostazol and demonstrated that SNF472 effectively inhibits CVC, resulting in superior outcomes across all evaluated parameters. These results suggest that SNF472 could be a promising therapeutic candidate for patients suffering from this severe form of PAD.

[spa] La enfermedad arterial periférica (PAD) es una condición vascular crónica caracterizada por el estrechamiento u obstrucción de las arterias, principalmente en las extremidades inferiores, induciendo complicaciones isquémicas. A diferencia de la PAD ateromatosa, donde las placas lipídicas obstruyen el flujo sanguíneo, existe un subtipo menos común pero más grave, definido como PAD calcificante. La PAD calcificante se produce por la calcificación en la capa arterial media, lo que reduce la compliancia vascular y causa isquemia severa. La PAD calcificante progresa rápidamente, produciendo intensos dolores, movilidad reducida y úlceras no cicatrizantes, así como un mayor riesgo de amputación de las extremidades y mortalidad en comparación con la PAD tradicional. Esta condición es particularmente prevalente en personas con enfermedad renal crónica (CKD), debido a disfunciones vasculares y metabólicas subyacentes, desequilibrios minerales sistémicos e inflamación crónica. Las terapias estándar para la PAD resultan ineficaces contra la calcificación, limitando las opciones de tratamiento para los pacientes con PAD calcificante. A pesar de las graves implicaciones clínicas, la investigación enfocada en comprender y tratar esta condición resulta insuficiente y los pacientes afectados son frecuentemente excluidos de los principales ensayos clínicos. Este problema se agrava por la ausencia de modelos preclínicos que repliquen con precisión la fisiopatología de la PAD calcificada, lo que dificulta explorar los mecanismos subyacentes o probar posibles terapias. Abordar esta brecha en la investigación y el tratamiento es esencial para mejorar los resultados en esta población vulnerable. Esta tesis busca establecer un modelo preclínico eficaz de PAD producido por la calcificación cardiovascular (CVC). El objetivo principal es replicar la calcificaciónn ectópica en ratas que presente características clave de la enfermedad, como la isquemia en extremidades inferiores y la función locomotora deteriorada. Además, el estudio evalúa el cilostazol, un tratamiento estándar para la PAD aterosclerótica, junto con el SNF472, un inhibidor de la calcificación ectópica, para comparar sus efectos terapéuticos sobre los parámetros clave de la enfermedad. Esta investigación implicó determinar la dosis óptima y el período de inducción con vitamina D3 para lograr un grado de calcificación capaz de simular el estado patológico de la enfermedad. Se emplearon técnicas avanzadas de imagen (histología, microtomografía computarizada (µ–CT) y microscopía electrónica de barrido (SEM)) para una caracterización integral de la CVC inducida. La tesis abarca cuatro ensayos in vivo para establecer una metodología sólida y reproducible. La severidad isquémica se cuantificó con imágenes de contraste por moteado láser (LSCI), mientras que las pruebas en cinta de correr evaluaron la capacidad locomotora. La calcificación total del tejido se evaluó mediante cuantificación de calcio por espectroscopía de emisión óptica por plasma acoplado inductivamente (ICP-OES), complementada con el análisis de biomarcadores en sangre. Se realizaron dos estudios de eficacia y uno de progresión para comparar los efectos terapéuticos de cilostazol y SNF472, junto con un estudio adicional sobre la respuesta a la dosis y los regímenes de administración de SNF472. Hemos desarrollado con éxito un modelo en rata que replica con precisión la condición patológica de la PAD calcificante en humanos. En este modelo, verificamos la falta de eficacia del cilostazol y la inhibición eficaz de la CVC por parte del SNF472, así como resultados superiores en todos los parámetros evaluados. Estos resultados sugieren que SNF472 podría ser un candidato terapéutico prometedor para pacientes que sufren esta forma severa de PAD.

[cat] La malaltia arterial perifèrica (PAD) és una condició vascular crònica caracteritzada per l’estrenyiment o obstrucció de les artèries, principalment a les extremitats inferiors, induint complicacions isquèmiques.. A diferència de la PAD ateromatosa, on les plaques de lípids obstrueixen el flux sanguini, existeix un subtipus menys comú però més greu definida com a PAD calcificant. La PAD calcificant està impulsada per la calcificació a la capa arterial mitjana, cosa que redueix la compliança vascular induint isquèmia severa i un perfil clínic més desfavorable. La PAD calcificant progressa ràpidament, provocant dolor intens, mobilitat reduïda i úlceres no cicatritzants, així com un elevat risc amputació de les extremitats i mortalitat en comparació amb la PAD tradicional. Aquesta condició és particularment prevalent en persones amb malaltia renal crònica (CKD), a causa de disfuncions vasculars i metabòliques subjacents, desequilibris minerals sistèmics i inflamació crònica. Les teràpies estàndard per a la PAD resulten ineficaces contra la calcificació. Com a resultat, els pacients amb PAD calcificant tenen opcions de tractament molt limitades i pitjor prognosi. Malgrat les greus implicacions clíniques, la investigació centrada a entendre i tractar aquesta condició resulta insuficient i els pacients afectats sovint són exclosos dels principals assajos clínics. Aquest problema s’agreuja per l’absència de models preclínics que repliquin amb precisió la fisiopatologia de la PAD calcificant, cosa que dificulta explorar els mecanismes subjacents o provar possibles teràpies. Abordar aquest espai en la investigació i el tractament és essencial per millorar els resultats en aquesta població vulnerable. Aquesta tesi té com a objectiu establir un model preclínic eficaç de PAD impulsat per la calcificació cardiovascular (CVC). L’objectiu principal és replicar característiques clau de la malaltia, com la isquèmia a les extremitats inferiors i la funció locomotora deteriorada, ambdues induïdes per la calcificació ectòpica. A més, l’estudi avalua el cilostazol, un tractament estàndard per a la PAD, juntament amb el SNF472, un inhibidor de la calcificació, per comparar-ne els efectes terapèutics sobre els paràmetres clau de la malaltia. La nostra investigació implicà determinar la dosi òptima i el període d’inducció de vitamina D3 per aconseguir un grau de calcificació capaç de simular l’estat patològic de la malaltia. Es van emprar tècniques avançades d’imatge (histologia, microtomografia computeritzada (µ–CT) i microscòpia electrònica d’escaneig (SEM)) per a la caracterització integral de la CVC induïda. La tesi inclou quatre assajos in vivo per establir una metodologia sòlida i reproduïble. La severitat isquèmica es va quantificar utilitzant imatges de contrast per motes làser (LSCI), mentre que les proves en cinta de córrer es van utilitzar per avaluar la capacitat locomotora. La calcificació total del teixits es va avaluar mitjançant la quantificació de calci per espectroscòpia d’emissió òptica per plasma acoblat inductivament (ICP-OES), complementada amb l’anàlisi de biomarcadors en sang. Es van dur a terme dos estudis d’eficàcia i un de progressió per comparar els efectes terapèutics del cilostazol i el SNF472, juntament amb un estudi addicional sobre la resposta a la dosi i els règims d’administració del SNF472. S’ha desenvolupat amb èxit un model de rata que reprodueix amb precisió la condició patològica de la PAD calcificant en humans. En aquest model, s’ha verificat la manca d’eficàcia del cilostazol i la inhibició eficaç de la CVC del SNF472, donant lloc a resultats superiors en tots els paràmetres avaluats. Aquests resultats suggereixen que el SNF472 podria ser un candidat terapèutic prometedor per als pacients que pateixen aquesta forma severa de PAD.