Engineering Artificial Protein Coronas on Mesoporous Silica Nanoparticles: A Targeted Approach for Pancreatic Cancer Therapy

Abstract

L’adenocarcinoma ductal pancreàtic (PDAC) és un dels tipus de càncer més letals a escala mundial, principalment a causa del seu diagnòstic habitualment tardà i de la ineficàcia dels tractaments actuals. En l'actualitat, la quimioteràpia representa el tractament principal per a aquesta malaltia, però la seva baixa eficàcia s’associa a la formació d’un estroma altament fibròtic, que incrementa la pressió intersticial i afavoreix el desenvolupament de resistències als fàrmacs. En aquest context, la nanomedicina emergeix com una disciplina innovadora i d’avantguarda capaç de millorar la farmacodinàmia dels principis actius.

Durant l’última dècada, els nanovehicles han guanyar rellevància en l’abordatge terapèutic del PDAC. Tanmateix, malgrat la seva capacitat d'interaccionar de manera específica amb les cèl·lules malignes i permetre una alliberació controlada del fàrmac, l’ús de nanosistemes presenta diverses limitacions que en disminueixen el potencial d’aplicació clínica. En particular, quan les nanopartícules s’administren per via sanguínia, la ràpida formació d’una corona proteica (PC) en la seva superfície neutralitza la seva capacitat de reconeixement cel·lular i afavoreix la seva captura per part del sistema mononuclear fagocític. Com a resultat, un 95% de les nanomedicines administrades són atrapades, fet que compromet la seva eficàcia terapèutica.

En la present tesi doctoral s’han proposat tres nanosistemes constituïts per nanopartícules mesoporoses de sílice (MSN), que han permès estudiar i dissenyar nanovehicles capaços de superar els desafiaments imposats per aquesta malaltia.

El primer sistema es basa en un nanovehicle capaç d'alliberar de manera controlada un conjugat de camptotecina i gemcitabina (CPT-GEM) en resposta al pH àcid dels lisosomes de les cèl·lules tumorals. Aquest enfocament té com a objectiu el tractament de l'adenocarcinoma ductal pancreàtic (PDAC) mitjançant teràpia combinada, una estratègia prometedora per superar l'aparició de resistències terapèutiques. Amb aquest propòsit, s’ha preparat una PC artificial al voltant de les MSNs mitjançant una nova molècula formada per un grup químic que és làbil en condicions àcides. El disseny d’aquesta molècula està enfocat a conjugar MSNs de 45 nm de diàmetre amb albúmina, mitjançant química clic lliure de coure com a catalitzador. El nanosistema resultant ha demostrat alliberar el conjugat CPT-GEM de manera selectiva a pH 5,5. A més, el recobriment amb albúmina ha reduït la internalització de les nanopartícules per part dels macròfags en 1,6 vegades respecte a les nanopartícules sense PC. Així mateix, la decoració de l’albúmina conjugada amb lligands específics ha millorat diverses capacitats del sistema. En concret, la incorporació d’un pèptid inhibidor de la fagocitosi ha reduït la internalització del nanovehicle davant els macròfags en 2,3 vegades respecte a les nanopartícules sense recobriment. D’altra banda, la incorporació d’un pèptid amb afinitat per un receptor sobreexpressat a la membrana de les cèl·lules pancreàtiques cancerígenes ha millorat la internalització del sistema entre 2 i 3 vegades en comparació amb MSNs amb albúmina.

En el segon sistema, el principal propòsit ha estat augmentar la citotoxicitat dels nanosistemes contra les cèl·lules tumorals pancreàtiques mitjançant la combinació de teràpia fotodinàmica i quimioteràpia. La generació d’espècies altament oxidants per part de la teràpia fotodinàmica ha permès el disseny d’una molècula sensible a l’oxigen singlet amb l’objectiu d’unir les MSNs amb albúmina. Aquesta estratègia ha donat lloc a un sistema d’alliberament controlat del fàrmac doxorubicina gràcies a una corona proteica sensible a l’oxigen singlet. A més, gràcies a la sinèrgia generada per la combinació de teràpies s’han aconseguit valors de mortalitat cel·lular molt alts a concentracions baixes del sistema en les línies cel·lulars humanes de tumor de pàncrees PANC-1 i MIA PaCa-2. Tanmateix, la incorporació del pèptid inhibitori de la fagocitosi ha resultat en una reducció de la captura del nanovehicle pels macròfags en un 3,5 vegades respecte a les nanopartícules sense corona.

El tercer nanovehicle s’ha desenvolupat amb l’objectiu de crear un sistema avançat potencialment capaç tant d’acumular-se en el microambient tumoral del càncer de pàncrees com de penetrar-hi. Per aconseguir-ho, aquest sistema s’ha carregat amb el conjugat CPT-GEM i s’ha dissenyat perquè sigui sensible a dos pHs, permetent-li reduir la seva mida gràcies a aquests estímuls. Concretament, les nanopartícules de 45 nm s’han recobert primerament amb una capa polimèrica mitjançant una molècula capaç de formar 2 enllaços làbils a diferent pH, seguida d’una cobertura d’albúmina. Aquest recobriment híbrid aconsegueix l’alliberament gradual i precís del conjugat a mesura que el pH disminueix progressivament de 7,4 a 5,5. Un cop el nanovehicle és a la matriu extracel·lular tumoral, a pH lleugerament àcids (6,8), el recobriment es trenca parcialment. Quan el sistema es internalitza a les cèl·lules pancreàtiques a través dels endosomes, el pH disminueix (5,5) i la cobertura híbrida es continua desprenent, permetent l’alliberament del conjugat. La posterior decoració de la corona proteica amb els pèptids mencionats dota el sistema de capacitats evasives fins a 4 vegades superiors a les nanopartícules sense recobriment, i una internalització específica a les cèl·lules pancreàtiques de 2 a 3 vegades més gran que les MSN amb PC sense decorar. Aquesta estratègia ha permès el disseny d’un sistema capaç d’augmentar la seva internalització a les cèl·lules pancreàtiques tumorals a través de diverses vies, amb un gran potencial per a la seva avaluació preclínica.

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es uno de los procesos cancerígenos más letales, principalmente debido a su diagnóstico habitualmente tardío y la ineficacia de los tratamientos existentes. Actualmente, la quimioterapia es el principal abordaje terapéutico contra esta enfermedad tan agresiva. Desafortunadamente, la formación de un estroma altamente fibrótico alrededor del tumor, que aumenta la presión intersticial y favorece el desarrollo de resistencias a fármacos, reduce, de esta manera, la eficacia de los tratamientos convencionales. La nanomedicina es una disciplina emergente y de vanguardia en este campo, capaz de mejorar la farmacodinamia de los fármacos. En la última década, los nanovehículos han ganado relevancia en el marco terapéutico del PDAC. No obstante, aunque los nanosistemas poseen la capacidad interactuar de manera específica a las células malignas y permitir una liberación controlada del fármaco, su aplicación presenta ciertas limitaciones que afectan su eficacia clínica. En cuanto las nanopartículas se administran por vía sanguínea, la rápida formación de una corona proteica (PC) a su alrededor neutraliza su capacidad de reconocimiento celular y favorece su captura por parte del sistema mononuclear fagocítico. Como resultado, un 95% de las nanomedicinas administradas son atrapadas, hecho que compromete su eficacia terapéutica.

En la presente tesis doctoral, se han propuesto tres nanosistemas constituidos por nanopartículas mesoporosas de sílice (MSN), que han permitido estudiar y diseñar nanovehículos capaces de superar los desafíos impuestos por el PDAC.

El primer sistema se diseñó con el objetivo de desarrollar nanopartículas recubiertas con una PC escindible a pH ácido, capaz de permitir la liberación controlada de un conjugado de camptotecina y gemcitabina (CPT-GEM) para el tratamiento del PDAC mediante terapia combinada, estrategia prometedora para combatir la aparición de resistencias. El sistema está compuesto por nanopartículas de sílice mesoporosas (MSNs) de 45 nm de diámetro, conjugadas con una corona de albúmina mediante una novedosa molécula enlazadora. Esta molécula presenta un enlace lábil en condiciones de pH ácido y facilita la unión de la albúmina a las nanopartículas utilizando química click libre de cobre como catalizador. El nanosistema híbrido resultante ha demostrado la liberación selectiva del conjugado CPT-GEM a pH 5,5, que simula el microambiente lisosomal de las células cancerígenas. Además, el recubrimiento de albúmina ha conseguido reducir 1,6 veces la internalización del sistema en macrófagos en comparación con MSNs no recubiertas. La posterior decoración de la PC con ligandos específicos ha mejorado algunas de las capacidades del sistema. La adicción de un péptido inhibitorio de la fagocitosis por parte de macrófagos ha incrementado la evasión del nanovehículo ante éstos 2-3 veces más respecto a las nanopartículas sin PC. Por otra parte, la adicción de un péptido con afinidad por un receptor sobreexpresado en la membrana de las células pancreáticas cancerígenas, ha mejorado la internalización del sistema en éstas de 2 a 3 veces.

En el segundo sistema, el objetivo principal ha sido aumentar la actividad citotóxica frente a las células tumorales pancreáticas mediante la combinación de las terapias fotodinámica y quimioterapia. La generación de especies altamente oxidantes ha permitido, además de una potente actividad citotóxica, la preparación de una PC sensible al oxígeno singlete, facilitando la liberación selectiva del antineoplásico doxorrubicina mediante irradiación con luz roja. Con este fin, se ha diseñado y sintetizado una molécula sensible al oxígeno singlete, capaz de conjugar las MSNs con albúmina mediante reacciones click. Además, la combinación de terapias ha conseguido un efecto sinérgico alcanzando altos niveles de mortalidad celular a bajas concentraciones del sistema en las líneas celulares humanas de tumor pancreático, PANC-1 y MIA PaCa-2. Asimismo, la incorporación del péptido inhibidor de la fagocitosis ha reducido la internalización del nanovehículo 3,5 veces en macrófagos con respecto a las nanopartículas sin corona.

El tercer nanovehículo se ha diseñado con el objetivo de desarrollar un nanosistema avanzado para la quimioterapia combinada, con el potencial de acumularse y penetrar en el complejo microambiente tumoral del PDAC. Para lograrlo, este sistema presenta sensibilidad a dos valores de pH, lo que le permite reducir su tamaño de manera gradual en respuesta a dichos estímulos. Específicamente, las MSNs de 45 nm se han conjugado con una envoltura polimérica mediante una molécula capaz de establecer dos enlaces lábiles a diferentes valores de pH, seguida de una posterior cobertura con albúmina. Este recubrimiento híbrido, consigue la liberación gradual y precisa del conjugado a medida que el pH disminuye progresivamente de 7,4 a 5,5. Una vez el nanosistema llega a la matriz extracelular tumoral, con un pH ligeramente ácidos (6,8), el recubrimiento se rompe parcialmente. Cuando el sistema se internaliza a las células pancreáticas a través de las endosomas, el pH disminuye (5,5) y la cobertura híbrida se continúa desprendiendo, permitiendo la liberación del conjugado. La posterior decoración de la PC con los péptidos mencionados dota al sistema de capacidades evasivas hasta 4 veces superiores a las nanopartículas sin recubrimiento y una internalización específica en las células pancreáticas, de 2 a 3 veces más grande que éstas. Esta estrategia ha permitido el diseño de un sistema capaz de aumentar su internalización en las células pancreáticas tumorales a través de diversas vías, con potencial para su evaluación preclínica.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal malignancies worldwide, primarily due to its late diagnosis and its unresponsiveness to standard treatments. At present, chemotherapy remains the cornerstone of treatment for this lethal disease. However, the presence of a highly fibrotic stroma surrounding pancreatic tumour cells significantly hampers the effectiveness of conventional chemotherapy due to elevated interstitial pressure and the development of drug resistances. Nanomedicine has emerged as a cutting-edge paradigm to enhance the pharmacodynamics of drugs. Over the past decade, nanocarriers have shown great promise as innovative platforms for the treatment and management of PDAC. However, despite their ability to target malignant cells and achieve controlled drug release, unresolved drawbacks continue to limit their clinical efficacy. Specifically, the rapid formation of a protein corona (PC) around nanosystems in the bloodstream not only neutralizes their targeting capabilities but also leads to the clearance of approximately 95% of administered nanoparticles, highly compromising the efficacy of nanomedicines. Paradoxically, the preparation of an artificial PC around nanoparticle’s surfaces has arisen as a promising strategy to overcome this challenge. Certainly, among the various proteins present in the human body, albumin demonstrates significant potential to inhibit macrophage phagocytosis.

In this PhD dissertation, three drug delivery systems (DDS) have been prepared, leveraging the well-defined properties of mesoporous silica nanoparticles (MSN), to study and design nanoconstructs capable of overcoming the challenges imposed by this disease.

The first nanocarrier was constructed with the aim to develop a pH-sensitive albumin corona-based nanoplatform able to release a conjugate of camptothecin and gemcitabine (CPT-GEM). This system was designed for combination chemotherapy against pancreatic tumour cells, with the goal of overcoming drug resistances. A novel pH-sensitive linker was synthetised to be cleaved at lysosomal pH. Its design allowed the conjugation of small nanoparticles (45 nm) with albumin coating through click chemistry. This strategy not only enabled the controlled release of the conjugate CPT-GEM under pH 5.5, but also endow the system with ability to avoid the macrophage uptake 1.6-fold more than non-coated MSNs. The subsequent decoration of the albumin corona with a phagocytosis inhibitor peptide enhances the system's evasion capability, resulting in a 2.3-fold increase in comparison with aminated MSNs. Additionally, the incorporation of U11 peptide with affinity for an overexpressed receptor in specific pancreatic tumour cells enables active targeting, resulting in a 2-3-fold increase in system internalisation in pancreatic tumour cell lines compared to aminated MSNs.

With the aim to further improve the cytotoxic activity of the combination chemotherapy, a second drug delivery system was designed to integrate two therapies, photodynamic therapy and chemotherapy. To this end, MSNs coated with an artificial PC linked to the nanoparticle through a novel singlet oxygen-sensitive linker were synthetised. The synergistic combination of dual therapy approaches was investigated in PANC-1 and MIA PaCa-2 pancreatic tumour cell lines. In vitro experiments revealed virtually complete eradication of both cell lines when treated with low concentrations of the nanocarrier. Furthermore, the decoration of the PC with a macrophage inhibitor peptide was investigated in this system, resulting in a 3.5-fold reduction in macrophage uptake compared to the precursor carrier.

A third nanocarrier was engineered with the goal of creating an advanced system capable of both accumulating in the tumour microenvironment and potentially penetrating it. To achieve this, a dual pH-responsive shrinkable system carrying the conjugate CPT-GEM was prepared. A dual coating, comprising a polymeric shell followed by an albumin corona, enabled the precise stepwise release of the conjugate as the pH progressively decreased from 7.4 to 5.5. This design facilitates partial release of the coating and conjugate at the extracellular matrix pH (6.8) and complete delivery at lysosomal pH (5.5) within pancreatic cancer cells. The functionalization of the protein coating with the aforementioned peptides resulted in up to a fourfold reduction in macrophage uptake and a 2- to 3-fold enhancement in internalization into pancreatic cancer cell lines compared to aminated MSNs. This approach led to the development of a nanosystem with significant potential to further enhance internalisation via multiple pathways in pancreatic cell lines, enabling the way for its preclinical evaluation.