Exploring novel target combinations for treating neurodegenerative diseases

Abstract

[eng] Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s disease (AD) and Parkinson’s disease (PD), affect millions of people worldwide and share common multifactorial characteristics, including neuroinflammation, oxidative stress, and protein aggregation. Due to the complexity of these diseases, this thesis focuses on exploring novel therapeutic strategies that have been poorly exploited to address AD and PD. Firstly, for AD, a bibliometric study on the development of multitarget drugs has revealed a significant increase in publications since 2011, with a predominant interest in linked hybrids, which mostly hit acetylcholinesterase (AChE), oxidative stress, and β-amyloid aggregation, while targets such as tau aggregation or GSK-3β remain relatively underexplored. Secondly, efforts have been made during this thesis to deepen into the understanding of protein aggregation by performing, in the frame of several collaborations, the evaluation in genetically modified Escherichia coli cells of the anti- aggregation activity of two structural series synthesized in this thesis and four different synthesized by others. It was observed that active anti-aggregating compounds display similar potencies against the aggregation of β-amyloid and tau proteins. Based on this information, new hybrid compounds have been designed to combine the inhibition of soluble epoxide hydrolase (sEH) and AChE with anti-aggregation properties. These compounds have demonstrated nanomolar potency against both targets, while effectively inhibiting the aggregation of β-amyloid, tau, and TDP-43 proteins. Moreover, they have shown to be non-neurotoxic, capable of crossing the blood-brain barrier, and have exhibited moderate aqueous solubility, making them good candidates for future in vivo evaluation. Regarding PD, this thesis has focused on the design of sEH inhibitors with specific anti-aggregation activity against α-synuclein. The new compounds have demonstrated high sEH inhibitory potency, significant α-synuclein anti-aggregation activity, and good DMPK and safety profile, thereby emerging as promising candidates for future preclinical studies in murine models. In addition to conventional multitarget strategies, targeted protein degradation (TPD) was explored as an alternative modality to tackle CNS-related proteins. One of the main needs in the field is to increase the toolbox of E3 ligases. In this context, novel ligands for KEAP1, an E3 ligase that degrades Nrf2—a key transcription factor with antioxidant effects—have been investigated. The aim is to develop a dual-action PROTACs, which could simultaneously increase Nrf2 levels to enhance antioxidant activity while degrading a protein of interest via KEAP1’s E3 ligase activity. Using MDMix calculations and virtual screening, 20 potential ligands were identified, five of which were biophysically validated. Among them three ligands showed micromolar affinity (Kd) towards the Kelch domain of KEAP1 and hints of upregulation of Nrf2-regulated genes. These results provided the foundation for the design and evaluation of new KEAP1-recruiting PROTACs incorporating the discovered ligands.

[cat] Les malalties neurodegeneratives, com l'Alzheimer (MA) i el Parkinson (MP), afecten milions de persones a tot el món i comparteixen característiques multifactorials comunes, com la neuroinflamació, l'estrès oxidatiu i l'agregació proteica. A causa de la complexitat d'aquestes malalties, la tesi se centra en explorar noves combinacions terapèutiques no descrites prèviament per abordar la MA i la MP des d’estratègies multidiana. En primer lloc, per a la MA, es va dur a terme un estudi bibliomètric sobre el desenvolupament de noves teràpies multidiana que va revelar un augment significatiu en les publicacions des de 2011, amb un interès predominant en estratègies basades en híbrids conjugats. Les dianes més investigades inclouen l'acetilcolinesterasa (AChE), l'estrès oxidatiu i l'agregació de β-amiloide, mentre que dianes com l'agregació de tau o la GSK-3β encara estan relativament poc explorades. En segon lloc, es va aprofundir en la comprensió de l'agregació de proteïnes, portant a terme, en el sí de vàries col·laboracions acadèmiques, l’avaluació de l'activitat antiagregant de 4 famílies diferents de compostos i de les 2 famílies estructurals sintetitzades en aquesta tesi. Es va observar que els compostos que son actius com a antiagregants presenten potències similars enfront l’agregació de les proteïnes β-amiloide i tau. Partint d’aquesta informació, es van dissenyar nous híbrids per combinar la inhibició de la hidrolasa d’epòxids solubles (sEH) i l’AChE, afegint també propietats antiagregants. Aquests compostos van demostrar potència nanomolar per a ambdues dianes, inhibint efectivament l'agregació de β-amiloide, tau i TDP-43. A més, van demostrar no ser neurotòxics, travessar la barrera hematoencefàlica i tenir una solubilitat aquosa moderada, posicionant-los com a bons candidats per a futures avaluacions in vivo. Pel que fa a la MP, aquesta tesi es va centrar l'atenció en el disseny d'inhibidors de sEH amb activitat antiagregant específica contra la proteïna α-sinucleïna, un marcador clau de la malaltia. Els nous compostos desenvolupats van mostrar alta potència inhibitòria de sEH, amb una significativa activitat antiagregant d’α-sinucleïna i un bon perfil de propietats DMPK i de seguretat, constituint així candidats prometedors per a futurs estudis preclínics en models murins. A més de les estratègies multidiana convencionals, es va explorar la degradació dirigida de proteïnes (TPD), una aproximació alternativa per abordar proteïnes difícils de modular amb fàrmacs. En aquest context, es va investigar KEAP1, una E3 ligasa que degrada Nrf2, un factor de transcripció clau amb efectes antioxidants. Amb l’objectiu de crear els primers PROTACs amb acció dual, d’una banda augmentant els nivells de Nrf2 i l’activitat antioxidant i d’altra banda per degradar una proteïna d’interès fent servir l’acció E3 lligasa de KEAP1. Mitjançant càlculs MDMix i cribatge virtual, es van identificar 20 possibles lligands, dels quals 5 van ser validats experimentalment amb tècniques com surface plasmon resonance (SPR) i fluorescence polarization (FP). D'aquests, 3 compostos van presentar una afinitat micromolar (Kd) i van mostrar capacitat per augmentar l'expressió de gens regulats per Nrf2. Aquests resultats van servir com a base per al disseny i l’avaluació de dos nous PROTACs que incorporen els lligands descoberts.