Contribution of the Rho GTPase Rnd3 in the regulation of Glioma cell motility and invasion

Abstract

[eng] Introduction GBMs constitute the most common CNS tumours, representing 14.2% of all tu-mours and 50.1% of malignant tumours. They stand among the most devastating hu-man cancers, characterized by a median overall survival of only 15 months. The chal-lenges in managing GBMs stem from several defining hallmarks, such as their en-hanced invasiveness and intratumoural heterogeneity, which includes the presence of a subpopulation of GSCs particularly resistant to radio- and chemotherapy. These fac-tors complicate complete resection and render the tumours highly resistant to current available therapies, resulting in modest responsiveness to standard treatment protocols involving radiotherapy and TMZ. In light of this landscape, extensive efforts have been directed toward characteriz-ing the molecular alterations underlying the aggressive nature of GBM. Among the identified alterations, abnormalities in receptor tyrosine kinases are prominent, with approximately 70% of GBM patients exhibiting alterations in at least one RTK, in-cluding EGFR, PDGFR, FGFR, and cMET. Oncogenic signalling emanating from RTKs affects various cellular cascades involved in cell proliferation, survival, and notably, cellular motility. Within this context, Rho GTPases emerge as pivotal regula-tors of the actin cytoskeleton. Among these proteins, the antagonistic proteins Rac1 and RhoA are the best characterised. While the former governs the formation of pro-invasive lamellipodia at the leading edge of cells, the latter modulates stress fibres (SF) and focal adhesion (FA) formation, and actomyosin contractility. A third member of this family, Rnd3, is an atypical Rho GTPase, constitutively bound to GTP and a well-known RhoA antagonist. The role of Rnd3 in cancer seems to be largely dependent on cellular context, with studies reporting divergent effects on cell motility and proliferation. In this thesis, we have investigated the molecular mechanisms gov-erning GBM cell motility, focusing on the interplay between RTKs and Rho GTPases, especially Rnd3. Research content Firstly, we focused on studying the impact of oncogenic RTK signalling on cellu-lar motility. The use of a panel of TKIs targeting EGFR, PDGFR/VEGFR, and c-MET revealed that inhibiting these RTKs results in a dramatic reorganization of the cellular cytoskeleton, promoting a phenotype characterized by the formation of SFs and FAs, which led to decreased cellular motility. These effects were reversed when disrupting the RhoA/ROCK signalling axis, suggesting that aberrant RTK activation sustains a Rho GTPase balance favouring the pro-invasive activity of Rac1 over RhoA; a balance that is reversed upon RTK inhibition, leading to the formation of structures typical of RhoA signalling and favouring a less invasive phenotype. Taken the antagonistic role of Rnd3 upon RhoA/ROCK activity, we then decided to focus on the specific contribution of this protein to the invasive phenotype of GBM. Inhibition of RTKs revealed that Rnd3 expression is indeed under the control of RTK signalling. Rnd3-mediated silencing essentially recapitulated all the observed effects promoted by RTK inhibition of actin cytoskeleton dynamics and cell motility. Con-versely, moderate Rnd3 overexpression prevented TKI-induced cytoskeleton reorgani-zation; altogether indicating that Rnd3 is an important mediator of the invasive pheno-type in GBM cells. In atypical Rho GTPases, canonical nucleotide cycling mechanisms diminish in importance compared to other regulatory mechanisms such as post-translational modi-fications and cellular expression modulation. Therefore, we conducted a bioin-formatic analysis to explore putative TFs involved in Rnd3 regulation. In this context, our data suggest a potential involvement of the AP-1 complex and JNK, as well as a potential implication of Rnd3 in the response to oxidative stress. Conclusion In conclusion, the evidence gathered in this thesis highlights the Rho GTPase Rnd3 as a significant player in the invasive context of GBM cells and opens the door to fu-ture lines of research delving into the regulatory mechanisms of its expression and its potential implication in the oxidative stress response.

[cat] Introducció Els glioblastomes (GBMs) constitueixen els tumors més comuns del sistema nerviós central, representant el 14.2% de tots els tumors i el 50.1% dels tumors malignes. Per desgràcia, destaquen per ser un dels càncers més devastadors, amb una supervivència mitjana de només 15 mesos. Aquestes xifres són el resultat d'un conjunt de característiques definitòries dels GBMs, que comprometen seriosament el seu maneig. Entre elles, podem destacar principalment l'elevada capacitat invasiva de les seves cèl·lules, que complica enormement la resecció quirúrgica completa, i l'heterogeneïtat intratumoral, en la jerarquia de la qual destaquen un conjunt de cèl·lules (denominades cèl·lules mare de glioma) que presenten gran resistència a la ràdio i quimioteràpia. Així doncs, aquests tumors presenten una pobra resposta als tractaments actuals, el protocol estàndard dels quals consisteix en la resecció quirúrgica seguida de radioteràpia i TMZ. En aquest context, s'han fet grans esforços per caracteritzar les alteracions moleculars subjacents a la naturalesa agressiva dels GBM. Entre elles, cal destacar l'elevada freqüència de l'alteració dels Receptors Tirosina Kinasa (RTKs), amb aproximadament un 70 % dels pacients exhibint alteracions en almenys un (sent el més freqüents EGFR, PDGFR, FGFR i c-MET). Aquesta hiperactivació oncogènica dels RTKs afecta vàries cascades de senyalització intracel·lular implicades en la regulació de nombrosos processos cel·lulars, com la proliferació cel·lular, la supervivència i, especialment, la motilitat cel·lular. Així, prenen especial importància les Rho GTPases, les proteïnes reguladores del citoesquelet d'actina per excel·lència. Entre els seus membres destaquen particularment Rac1 i RhoA, que a més solen presentar antagonisme funcional. Mentre que la primera regula la formació dels lamelipodis, estructures pro-invasives que es formen al front d'avanç cel·lular, la segona està implicada en la formació de les fibres d'estrès i les adhesions focals, així com en la contracció dels feixos d'actomiosina. D'especial importància en aquesta tesi és Rnd3, una Rho GTPasa atípica que es troba constitutivament unida a GTP, i amb una activitat com a antagonista de RhoA ben descrita. El paper de Rnd3 en el context tumoral està subjecte a controvèrsia, amb estudis descrivint efectes divergents en diverses funcions cel·lulars, com la motilitat i la proliferació, depenent del model d'estudi. Per això, l'objectiu principal de la present tesi ha estat l'estudi dels mecanismes moleculars que regulen la motilitat cel·lular de les cèl·lules de GBM, centrant-nos en la interacció entre els RTKs i les Rho GTPases, principalment a Rnd3. Contingut de la recerca En primer lloc, ens vàrem centrar en estudiar l'impacte de la senyalització oncogènica dels RTK en la motilitat cel·lular. La utilització d'un grup d'inhibidors dirigits a EGFR, PDGFR/VEGFR i c-MET va revelar que la seva inhibició comporta una reorganització dràstica de la configuració del citoesquelet d'actina, promovent un fenotip caracteritzat per la formació de fibres d'estrès i adhesions focals que redueix notablement la motilitat cel·lular. Aquests efectes es van veure revertits en interrompre l'eix de senyalització RhoA/ROCK, suggerint que la hiperactivació dels RTKs sosté un equilibri en les Rho GTPases que afavoreix l'activitat proinvasiva de Rac1 en detriment de RhoA. Aquest equilibri es reverteix en inhibir els RTK, fet que comporta la formació d'estructures característiques de la senyalització conduïda per RhoA, afavorint un fenotip menys invasiu. Donada la funció antagonista de Rnd3 sobre l'activitat de RhoA/ROCK, posteriorment ens vàrem enfocar en la contribució específica de Rnd3 al fenotip invasiu dels GBMs. La inhibició dels RTK va revelar que l'expressió de Rnd3 es troba sota el control de la senyalització d'aquests receptors, i el seu silenciament va comportar la recuperació de tots els efectes sobre el citoesquelet d’actina i la motilitat cel·lular observats prèviament al inhibir els RTKs. Per contra, la sobreexpressió moderada de Rnd3 va evitar la reorganització del citoesquelet observada al inhibir els RTKs. En conjunt, aquestes dades indiquen que Rnd3 és un important mediador del fenotip de les cèl·lules de GBM. A les Rho GTPases atípiques, els mecanismes de regulació canònics de canvi de nucleòtids perden importància davant d'altres mecanismes, com les modificacions post-transcripcionals o la regulació de l'expressió gènica. Per això, a la part final del projecte ens vàrem centrar en la cerca de possibles factors de transcripció implicats en la regulació del gen RND3. L'anàlisi bioinformàtica i els experiments preliminars realitzats suggereixen una possible participació del complex AP-1 i JNK en la regulació de l'expressió del gen RND3, així com una implicació potencial de Rnd3 en la resposta cel·lular a estrès oxidatiu. Conclusió En conclusió, les dades recopilades al llarg de la present tesi assenyalen la Rho GTPasa Rnd3 com un mediador important en el context invasiu de les cèl·lules de GBM. A més, obre la porta a futures línies de recerca que aprofundeixin en els mecanismes de regulació de la seva expressió gènica, així com en el possible paper en la resposta davant l'estrès oxidatiu.

[spa] Introducción Los glioblastomas (GBMs) constituyen los tumores más comunes del sistema nervioso central, representando el 14.2% de todos los tumores y el 50.1% de los tumores malignos. Por desgracia, destacan por ser uno de los cánceres con peor prognosis, con una supervivencia media de tan solo 15 meses. Su agresividad es debida a un conjunto de características definitorias que comprometen seriamente su abordaje. Entre ellas, podemos destacar principalmente la elevada capacidad invasiva de sus células, que complica enormemente la resección quirúrgica completa, y la heterogeneidad intratumoral, en cuya jerarquía destacan un conjunto de células (denominadas células madre de glioma) que presentan gran resistencia a la radio y quimioterapia. Así pues, estos tumores presentan una respuesta limitada a los tratamientos actuales, cuyo protocolo estándar consiste en la resección quirúrgica seguida de radioterapia y temozolomida. En este contexto, se han hecho enormes esfuerzos para caracterizar las alteraciones moleculares que subyacen a la naturaleza agresiva de los GBMs. Entre ellas, cabe destacar la elevada frecuencia de la alteración de los Receptores Tirosina Kinasa (RTKs), con aproximadamente un 70 % de los pacientes exhibiendo alteraciones en al menos uno de ellos (siendo lo más frecuentes EGFR, PDGFR, FGFR y c-MET). Esta hiperactivación oncogénica de los RTKs afecta a numerosas cascadas de señalización intracelular implicadas en la regulación de varios procesos celulares, como la proliferación celular, la supervivencia y, especialmente, la motilidad celular. Así, toman especial importancia la familia de Rho GTPasas, proteínas reguladoras por excelencia del citoesqueleto de actina. Entre sus miembros destacan particularmente Rac1 y RhoA, que además presentan actividad antagonista. Mientras que la primera regula la formación de los lamelipodios, estructuras pro-invasivas que se forman en el frente de avance celular, la segunda está implicada en la constitución de las fibras de estrés y las adhesiones focales, así como en la contracción de los haces de actomiosina. De especial importancia en la presente tesis es Rnd3, una Rho GTPasa atípica que se encuentra constitutivamente unida a GTP, y cuya actividad como antagonista de RhoA es bien conocida. El papel de Rnd3 en el contexto tumoral se encuentra sujeto a controversia, con estudios describiendo efectos divergentes en varias funciones celulares, como la motilidad y la proliferación, dependiendo del modelo de estudio. Por ello, el objetivo principal de la presente tesis ha sido el análisis de los mecanismos moleculares que regulan la motilidad de las células de GBM, centrándonos en la interacción entre los RTKs y las Rho GTPasas, principalmente en Rnd3. Contenido de la investigación En primer lugar, nos centramos en estudiar el impacto de la señalización oncogénica de los RTKs en la motilidad celular. La utilización de un panel de inhibidores dirigidos a EGFR, PDGFR/VEGFR y c-MET reveló que su inhibición conlleva una reorganización drástica de la configuración del citoesqueleto de actina, promoviendo un fenotipo caracterizado por la formación de fibras de estrés y adhesiones focales que reduce notablemente la motilidad celular. Estos efectos se vieron revertidos al interrumpir el eje de señalización RhoA/ROCK, sugiriendo que la hiperactivación de los RTKs sostiene un equilibrio en las Rho GTPasas que favorece la actividad proinvasiva de Rac1 en detrimento de RhoA. Este equilibrio se revierte al inhibir los RTKs, lo que resulta en la formación de estructuras características de la señalización mediada por RhoA, favoreciendo un fenotipo menos invasivo. Dada la función antagonista de Rnd3 sobre la actividad de RhoA/ROCK, posteriormente decidimos enfocarnos en la contribución específica de Rnd3 al fenotipo invasivo de los GBMs. La inhibición de los RTK reveló que la expresión de Rnd3 se encuentra bajo el control de la señalización de estos receptores, y su silenciamiento recapituló todos los efectos observados previamente tras la inhibición de los RTKs sobre el citoesqueleto de actina y la motilidad celular. Por el contrario, la sobreexpresión de Rnd3 evitó la reorganización del citoesqueleto observada tras la inhibición de los RTKs. En conjunto, estos datos indican que Rnd3 es un importante mediador del fenotipo de las células de GBM. En las Rho GTPasas atípicas, los mecanismos de regulación canónicos de cambio de nucleótidos pierden importancia frente a otros mecanismos, como las modificaciones post-transcripcionales o la regulación de la expresión génica. Por ello, en la parte final del proyecto decidimos centrarnos en la búsqueda de potenciales factores de transcripción implicados en la regulación del gen RND3. El análisis bioinformático y los experimentos preliminares realizados sugieren una posible participación del complejo AP-1 y JNK en la regulación de la expresión del gen RND3, así como una potencial implicación de Rnd3 en la respuesta celular a estrés oxidativo. Conclusión En conclusión, los datos recopilados a lo largo de la presente tesis señalan a la Rho GTPasa Rnd3 como un mediador importante en el contexto invasivo de las células de GBM. Además, abre la puerta a futuras líneas de investigación que profundicen en los mecanismos de regulación de su expresión génica, así como en su posible papel en la respuesta celular a estrés oxidativo.