Hazard assessment of long-term pulmonary exposure to nanoplastics using new approach methodologies

Abstract

Els plàstics són essencials en la vida moderna per les seves propietats versàtils, el baix cost de producció i les múltiples aplicacions, des d’envasos i roba fins a la construcció i l’electrònica. No obstant això, la seva producció massiva no va acompanyada d’una gestió adequada dels residus, cosa que provoca la seva acumulació a l’aire, l’aigua i el sòl. Amb el temps, els plàstics es degraden en micro- i nanoplàstics (MNPLs) mitjançant processos físics, químics i biològics. A més, alguns MNPLs es fabriquen intencionadament per al seu ús en productes com productes de neteja i aplicacions mèdiques. L’ús generalitzat dels plàstics ha incrementat la presència de MNPLs en entorns humans, especialment en interiors, on s’han detectat concentracions elevades. Aquestes partícules poden interactuar amb barreres humanes com el tracte respiratori, gastrointestinal i la pell. Tot i que la ingestió ha estat considerada la principal via d’exposició, estudis recents indiquen que la inhalació podria ser igual o més rellevant. Malgrat això, hi ha poques dades sobre els efectes dels MNPLs als pulmons, especialment a llarg termini. Aquesta tesi aborda aquesta mancança mitjançant el desenvolupament de models avançats in vitro per avaluar els riscos respiratoris a llarg termini dels MNPLs, centrant-se en materials diferents del poliestirè, que ha estat el més estudiat. Es va establir un model de cèl·lules epitelials bronquials Calu-3 en condicions d’interfície aire-líquid, que simula l’epiteli bronquial humà i permet estudis prolongats. Amb aquest model, es van avaluar els efectes dels nanoplàstics d’àcid polilàctic (PLA-NPLs) en exposicions a curt i llarg termini. Tot i que no es van observar canvis significatius en la resistència elèctrica transepitelial, sí que es va detectar un augment en la permeabilitat i una disminució en la integritat de les unions estretes a concentracions altes i exposicions prolongades, cosa que suggereix un possible deteriorament de la barrera epitelial. A més, es va observar bioacumulació de PLA-NPLs: en exposicions a curt termini, la internalització va ser dependent de la dosi, mentre que en exposicions a llarg termini, fins i tot dosis baixes van provocar una acumulació progressiva, cosa que podria amplificar els efectes nocius. Per avaluar la toxicitat, es van analitzar la genotoxicitat i les respostes inflamatòries. Fins i tot exposicions curtes van causar dany significatiu a l’ADN, que es va intensificar amb el temps. Les respostes inflamatòries, mesurades mitjançant la producció de citocines, també van ser més pronunciades en exposicions prolongades. Aquests resultats indiquen que l’exposició crònica als MNPLs pot augmentar el dany biològic, subratllant la necessitat de models d’avaluació a llarg termini. Una de les principals llacunes en la literatura és la manca de dades sobre el potencial carcinogen dels MNPLs. Tot i que limitada, l’evidència suggereix una possible relació entre l’exposició als MNPLs i el càncer, especialment a través de mecanismes com la inflamació i l’estrès oxidatiu. Per investigar-ho, es va desenvolupar un model d’exposició prolongada amb cèl·lules bronquials BEAS-2B per avaluar el potencial carcinogen dels NPLs de tereftalat de polietilè (PET). Després de 30 setmanes d’exposició, es van observar genotoxicitat, creixement independent d’ancoratge, comportament invasiu i canvis moleculars oncogènics, tots ells indicadors de transformació cel·lular. Es van identificar 18 gens com a possibles biomarcadors primerencs de transformació, amb alteracions significatives fins i tot abans que es manifestessin canvis fenotípics. En conclusió, aquesta tesi demostra la importància dels models d’exposició a llarg termini per avaluar els riscos dels MNPLs en el sistema respiratori. Aporta evidència sobre la seva capacitat de bioacumulació, alteració de les barreres epitelials i potencial carcinogen, i proposa un enfocament integrat que combina exposició in vitro obtenció de dades de transcriptómica i anàlisi bioinformàtica per a una avaluació toxicològica més precisa i completa.

Los plásticos son esenciales en la vida moderna por sus propiedades versátiles, bajo costo de producción y múltiples aplicaciones, desde envases y ropa hasta construcción y electrónica. Sin embargo, su producción masiva no se acompaña de una gestión adecuada de residuos, lo que provoca su acumulación en el aire, el agua y el suelo. Con el tiempo, los plásticos se degradan en micro- y nanoplásticos (MNPLs) mediante procesos físicos, químicos y biológicos. Además, algunos MNPLs se fabrican intencionalmente para su uso en productos como productos de limpieza y aplicaciones médicas. El uso generalizado de plásticos ha incrementado la presencia de MNPLs en entornos humanos, especialmente en interiores, donde se han detectado concentraciones elevadas. Estas partículas pueden interactuar con barreras humanas como el tracto respiratorio, gastrointestinal y la piel. Aunque la ingestión ha sido considerada la principal vía de exposición, estudios recientes indican que la inhalación podría ser igual o más relevante. A pesar de ello, los datos sobre los efectos de los MNPLs en los pulmones, especialmente a largo plazo, son escasos. Esta tesis aborda esa carencia mediante el desarrollo de modelos avanzados in vitro para evaluar los riesgos respiratorios a largo plazo de los MNPLs, centrándose en materiales distintos al poliestireno (PS), que ha sido el más estudiado. Se estableció un modelo de células epiteliales bronquiales Calu-3 bajo condiciones de interfaz aire-líquido (ALI), que simula el epitelio bronquial humano y permite estudios prolongados. Con este modelo, se evaluaron los efectos de los nanoplásticos de ácido poliláctico (PLA-NPLs) en exposiciones a corto y largo plazo. Aunque no se observaron cambios significativos en la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), sí se detectó un aumento en la permeabilidad y una disminución en la integridad de las uniones estrechas a concentraciones altas y exposiciones a largo plazo, lo que sugiere un posible deterioro de la barrera epitelial. Además, se observó bioacumulación de PLA-NPLs: en exposiciones a corto plazo, la internalización fue dependiente de la dosis, mientras que en exposiciones a largo plazo, incluso dosis bajas provocaron acumulación progresiva, lo que podría amplificar efectos nocivos. Para evaluar la toxicidad, se analizaron la genotoxicidad y las respuestas inflamatorias. Incluso exposiciones breves causaron daño significativo al ADN, que se intensificó con el tiempo. Las respuestas inflamatorias, medidas mediante la producción de citocinas, también fueron más pronunciadas en exposiciones prolongadas. Estos resultados indican que la exposición crónica a MNPLs puede aumentar el daño biológico, subrayando la necesidad de modelos de evaluación a largo plazo. Una de las principales lagunas en la literatura es la falta de datos sobre el potencial carcinogénico de los MNPLs. Aunque limitada, la evidencia sugiere una posible relación entre la exposición a MNPLs y el cáncer, especialmente a través de mecanismos como la inflamación y el estrés oxidativo. Para investigar esto, se desarrolló un modelo de exposición prolongada con células bronquiales BEAS-2B para evaluar el potencial carcinogénico de los NPLs de tereftalato de polietileno (PET). Tras 30 semanas de exposición, se observaron genotoxicidad, crecimiento independiente de anclaje, comportamiento invasivo y cambios moleculares oncogénicos, todos ellos indicadores de transformación celular. Se identificaron 18 genes como posibles biomarcadores tempranos de transformación, con alteraciones significativas incluso antes de que se manifestaran cambios fenotípicos. En conclusión, esta tesis demuestra la importancia de modelos de exposición a largo plazo para evaluar los riesgos de los MNPLs en el sistema respiratorio. Aporta evidencia sobre su capacidad de bioacumulación, alteración de barreras epiteliales y potencial carcinogénico, y propone un enfoque integrado que combina exposición in vitro, obtención de datos de transcriptómica y análisis bioinformáticos para una evaluación toxicológica más precisa y completa.

Plastics have become foundational to modern life due to their versatile properties, low production costs, and wide-ranging Applications, from packaging and clothing to construction and electronics. However, their massive production is not matched by effective waste management, leading to accumulation in air, water, and soil. Over time, plastics degrade into micro- and nanoplastics (MNPLs) through physical, chemical, and biological processes. These particles are also intentionally produced for use in industries like nanomedicine and cleaning products. The widespread use of plastics has led to increased MNPL pollution in human environments. Studies have detected MNPLs in various settings, with indoor environments showing particularly high concentrations, posing potential health risks. MNPLs can interact with human barriers such as the respiratory and gastrointestinal tracts and the skin. While ingestion has traditionally been considered the main exposure route, recent evidence suggests inhalation may be equally or more significant. Despite this, data on MNPL effects in lung tissues remain limited, especially for long-term exposure. This thesis addresses that gap by developing advanced in vitro models to assess the long-term respiratory hazards of MNPLs, focusing on materials beyond the commonly studied polystyrene (PS). A Calu-3 bronchial epithelial cell model under air-liquid interface (ALI) conditions was established to simulate human bronchial epithelium and support long-term exposure studies. Using this model, the effects of polylactic acid (PLA)-NPLs were evaluated under both short- and long-term exposure. While no significant changes in transepithelial electrical resistance (TEER) were observed, increased permeability and reduced tight junction integrity were noted at higher concentrations and longer exposures. These findings suggest that prolonged exposure may compromise epithelial barriers. The model also enabled tracking of PLA-NPL bioaccumulation. In short-term scenarios, internalization was dose-dependent, while in long-term exposures, even low doses led to increased accumulation over time, raising concerns about potential magnification of harmful effects. To further assess toxicity, the study examined genotoxicity and inflammatory responses. Even short-term exposure caused significant DNA damage, which was exacerbated in long-term scenarios. Inflammatory responses, measured via cytokine production, were also more pronounced with prolonged exposure. These results indicate that long-term exposure to MNPLs may amplify biological harm, emphasizing the need for chronic exposure models in hazard assessment. A major knowledge gap identified in the literature is the lack of data on the carcinogenic potential of MNPLs. Although limited, existing studies suggest a possible link between MNPL exposure and cancer, particularly through mechanisms like inflammation and oxidative stress—both known contributors to lung cancer development. To explore this, a long-term exposure model using BEAS-2B bronchial cells was developed to assess the carcinogenic potential of polyethylene terephthalate (PET)-NPLs. After 30 weeks of exposure, PET-NPLs induced genotoxicity, anchorage-independent growth, invasive behavior, and oncogenic molecular changes—hallmarks of cellular transformation. Molecular analyses revealed progressive gene expression changes and pathway enrichment consistent with carcinogenesis. Eighteen genes were identified as potential early biomarkers of transformation, showing significant dysregulation even before visible phenotypic changes occurred. In summary, this thesis highlights the importance of long-term exposure models in evaluating MNPL hazards, particularly in the respiratory system. It provides new insights into the chronic effects of MNPLs, including their potential to bioaccumulate, disrupt epithelial barriers, and induce genotoxic and inflammatory responses. Most notably, it presents the first integrated approach combining long-term in vitro exposure with trancriptomic data collection and bioinformatics to assess carcinogenic mechanisms, offering a more sensitive and comprehensive framework for toxicological evaluation.