Efectos fenotípicos y resistencia asociada a la adaptación de Listeria monocytogenes a concentraciones subinhibitorias de desinfectantes de uso alimentario

Abstract

La seguretat alimentària és un dels principals reptes de la indústria alimentària actual, i la higiene de superfícies industrials és un punt crític, sobretot en entorns de post processament. La presència de biofilms, zones de difícil accés i l'aplicació desigual de desinfectants poden exposar els bacteris a concentracions subinhibitòries de biocides, afavorint adaptacions que comprometen l'eficàcia higiènica. Listeria monocytogenes, per la seva capacitat de formar biofilms, resistir ambients hostils i adherir-se a superfícies, és un patogen persistent rellevant per a la salut pública. Aquesta tesi doctoral avalua l’impacte de l’exposició prolongada a dosis subinhibitòries de tres desinfectants habituals clorur de benzalconi (BKC), àcid peracètic (PAA) i hipoclorit sòdic (HS) sobre diversos fenotips de L. monocytogenes: formació de biofilms, hidrofobicitat superficial, resistència a antimicrobians i supervivència en formatge Mahón-Menorca. Inicialment, es va avaluar la susceptibilitat als desinfectants. El BKC fou el més eficaç contra les soques salvatges, però també el que va induir major tolerància després de l’adaptació, amb increments de fins a 70 vegades en la MIC. L’HS requerí concentracions molt més altes per ser bactericida, mentre que el PAA mostrà una eficàcia intermèdia. L’anàlisi multivariant revelà que HS provocà els canvis fenotípics més marcats. La formació de biofilms es va mantenir elevada després de l’adaptació a BKC, amb estructures més compactes i organitzades. En canvi, l’adaptació a PAA i HS reduí l’adhesió en algunes soques, tot i que es van observar cúmuls cel·lulars aïllats. L'hidrofobicitat superficial, analitzada amb la tècnica MATS, va augmentar significativament en soques adaptades a PAA i HS. Les soques salvatges eren majoritàriament dèbilment hidrofòbiques (<20%). No obstant això, no es trobà correlació directa entre hidrofobicitat i biofilm, suggerint mecanismes reguladors diferents. Les soques salvatges van mostrar sensibilitat elevada als antibiòtics, però l’adaptació a BKC va incrementar significativament la resistència, especialment a antibiòtics clínics com ampicil·lina i gentamicina. El 85% de les soques adaptades a BKC es classificaren com a multiresistents. El PAA no induí canvis fenotípics destacables, mentre que l’HS provocà respostes variables segons la soca. Finalment, es va estudiar la supervivència de la soca CECT 5672 (salvatge i adaptada) en formatge Mahón-Menorca semicurat i curat. Les soques adaptades a BKC van mostrar major persistència, especialment al formatge curat. Les soques adaptades a HS també persistiren més temps, mentre que l’adaptació a PAA no aportà cap avantatge clar. En conclusió, l’adaptació a BKC representa el major risc sanitari, en afavorir persistència i multiresistència. L’HS tingué un efecte intermedi i el PAA es mostrà com el desinfectant més segur. Aquests resultats destaquen la importància d’estratègies de desinfecció racionals, evitant exposicions subinhibitòries i afavorint la rotació de biocides. Comprendre l’adaptació bacteriana és clau per evitar la selecció de soques resistents i protegir la salut pública.

La seguridad alimentaria es uno de los principales retos de la industria alimentaria moderna, siendo la higiene de superficies industriales un punto crítico, especialmente en zonas de manipulación post-proceso. La presencia de biofilms, zonas de difícil acceso y una aplicación desigual de desinfectantes favorecen la exposición de bacterias a concentraciones subinhibitorias de biocidas, lo que puede inducir adaptaciones que comprometen la eficacia higiénica. Listeria monocytogenes, por su capacidad de formar biofilms, resistir ambientes hostiles y adherirse a superficies, representa un patógeno persistente de gran relevancia para la salud pública. Esta tesis doctoral estudia el impacto de la exposición prolongada a dosis subinhibitorias de tres desinfectantes comunes (cloruro de benzalconio (BKC), ácido peracético (PAA) e hipoclorito de sodio (HS)) sobre diferentes aspectos fenotípicos de L. monocytogenes, como la formación de biofilms, la hidrofobicidad superficial, la resistencia antimicrobiana y la supervivencia en queso Mahón-Menorca. Inicialmente, se evaluó cómo la adaptación a los desinfectantes afecta los valores de MIC y MBC. BKC resultó el más eficaz frente a cepas salvajes, pero también el que indujo los mayores incrementos de tolerancia tras la adaptación, con aumentos de hasta 70 veces en MIC. HS requirió concentraciones mucho más altas para ejercer efecto bactericida, mientras que PAA mostró una capacidad intermedia. Los análisis multivariantes revelaron que HS provocó los cambios fenotípicos más marcados, mientras que la adaptación a BKC y PAA fue más variable. En cuanto a la formación de biofilms, las cepas salvajes mostraron una elevada capacidad, con valores entre 6,4 y 7,5 log UFC/cm². La adaptación a BKC mantuvo alta capacidad biofilm, con estructuras más compactas y organizadas. Por el contrario, la adaptación a PAA y HS redujo la adhesión en algunas cepas, aunque en ciertos casos se observaron cúmulos celulares aislados. La hidrofobicidad superficial se analizó mediante la técnica MATS, destacando el hexadecano como disolvente más discriminativo. Las cepas salvajes mostraron hidrofobicidad baja (<20%), mientras que la adaptación a PAA y HS incrementó notablemente este valor en la mayoría de las cepas. No obstante, no se halló correlación directa entre hidrofobicidad y formación de biofilms, indicando mecanismos reguladores distintos. Respecto a la resistencia a antibióticos, las cepas salvajes fueron generalmente sensibles, pero la adaptación a BKC generó un aumento preocupante en la resistencia, especialmente a antibióticos clínicos como ampicilina y gentamicina. Un 85% de las cepas adaptadas a BKC fueron clasificadas como multirresistentes y algunas como extensamente o panresistentes. PAA indujo escasos cambios fenotípicos, mientras que HS generó respuestas variables según la cepa. Finalmente, se estudió la supervivencia de la cepa CECT 5672 (salvaje y adaptada) en queso Mahón-Menorca semicurado y curado. La cepa adaptada a BKC presentó mayor tolerancia y persistencia, especialmente en el queso curado, probablemente favorecida por su menor actividad de agua y mayor contenido de sal. La cepa adaptada a HS también mostró una mayor supervivencia que la salvaje, mientras que la adaptación a PAA no ofreció ventajas claras. En conclusión, la adaptación a BKC representa el mayor riesgo sanitario, al favorecer tanto la persistencia como la multirresistencia. HS mostró un comportamiento intermedio y PAA emergió como el desinfectante más seguro. Estos hallazgos refuerzan la necesidad de estrategias de desinfección racionales, que eviten la exposición subinhibitoria y promuevan el uso rotativo o combinado de biocidas. Comprender los mecanismos de adaptación bacteriana es clave para evitar la selección de cepas resistentes y proteger la salud pública.

Food safety is one of the major challenges facing the modern food industry, with industrial surface hygiene being a critical point, especially in post-processing environments. The presence of biofilms, hard-to-reach areas, and uneven disinfectant application can expose bacteria to subinhibitory concentrations of biocides, promoting adaptations that compromise hygiene effectiveness. Listeria monocytogenes, due to its ability to form biofilms, resist hostile environments, and adhere to surfaces, is a persistent pathogen of public health concern. This PhD thesis explores the impact of prolonged exposure to subinhibitory doses of three common disinfectants benzalkonium chloride (BKC), peracetic acid (PAA), and sodium hypochlorite (HS) on L. monocytogenes phenotypes such as biofilm formation, surface hydrophobicity, antimicrobial resistance, and survival in Mahón-Menorca cheese. Initially, susceptibility to disinfectants was assessed. BKC was the most effective against wild strains but also induced the highest tolerance after adaptation, with MIC increases up to 70-fold. HS required much higher concentrations for bactericidal effect, while PAA had intermediate efficacy. Multivariate analyses revealed that HS caused the most marked phenotypic changes, while responses to BKC and PAA were more heterogeneous. Biofilm formation remained high after BKC adaptation, with more compact and structured biofilms. In contrast, adaptation to PAA and HS reduced adhesion in some strains, though isolated cell clusters were still observed. Surface hydrophobicity, assessed via MATS technique, increased significantly in most strains adapted to PAA and HS. Wild strains were mostly weakly hydrophobic (<20%). However, no direct correlation was found between hydrophobicity and biofilm production, suggesting different regulatory mechanisms. Wild-type L. monocytogenes strains were highly sensitive to antibiotics, but BKC adaptation significantly increased resistance, especially to clinically relevant antibiotics like ampicillin and gentamicin. About 85% of BKC-adapted strains were classified as multidrug-resistant. PAA caused minimal changes, while HS led to strain-dependent variable responses. Finally, the survival of strain CECT 5672 (wild and adapted) was tested in semi-cured and cured Mahón-Menorca cheese. BKC-adapted strains showed higher persistence, particularly in cured cheese, possibly due to lower water activity and higher salt. HS-adapted strains also persisted longer than wild strains, while PAA adaptation offered no clear survival advantage. In conclusion, BKC adaptation poses the greatest health risk, promoting both persistence and multidrug resistance. HS showed intermediate effects, and PAA proved the safest. These results highlight the importance of rational disinfection strategies that avoid subinhibitory exposure and favor biocide rotation. Understanding bacterial adaptation is key to controlling resistant strains and safeguarding public health.