Anàlisi “ex vivo” de mecanismes d’inducció d’apoptosi i resistència al tractament en gliomes malignes

Abstract

El glioblastoma multiforme és una de les neoplàsies més agressives de l’adult, malgrat els esforços realitzats en millorar el seu tractament, la supervivència dels pacients continua sent dolenta. L’objectiu global d’aquesta tesi ha estat l’estudi dels mecanismes moleculars implicats en la inducció de mort, parada de cicle pels inhibidors de MDM2 i els inhibidors de survivina en el glioblastoma multiforme humà, a més ha permès l’establiment de cultius primaris de glioblastoma humà. L’efecte dels compostos s’ha estudiat ex vivo en els cultius primaris i línies cel•lulars de glioblastoma multiforme humà.

Les Nutlines són antagonistes de MDM2 que actuen, amb una gran especificitat, desplaçant la unió de la proteïna p53 del seu inhibidor MDM2 a un rang de dosi nanomolar, el qual comporta l’estabilització de la molècula de p53 i la posterior activació de la seva via de senyalització. Els resultats del tractament de cultius primaris i línies cel•lulars de glioblastoma demostren que la Nultina-3a és capaç de induir parada de cicle cel•lular (p21), apoptosi (Noxa i Puma), a més de induir senescència (marcatge amb SA-βGal) en aquelles cèl•lules amb un p53 funcional. Per el contrari, les línies cel•lulars i cultius primaris amb un p53 no funcional, són resistents al tractament degut a l’incapacitat de aquestes cèl•lules per activar la via de p53. El pretractament amb Nutlina-3a sensibilitza la línia cel•lular U87-MG enfront la radioteràpia. Això suggereix que la utilització de inhibidors de MDM2 podria ser una nova estratègia terapèutica, ja sigui de forma individual o combinada amb radioteràpia en el tractament de pacients amb glioblastoma multiforme amb una proteïna p53 funcional.

YM155 (1-(2-metoxietil)-2-metil-4,9-dioxo-3-(piracina-2 ymetil)-4,9-dihidro-1H-nafto[2,3-d ]bromuro de imidazolium), és una petita molècula inhibidora de la proteïna antiapoptòtica Survivina. YM155 va ser seleccionat mitjançant un cribratge d’alt rendiment com supressor específic de l'expressió de survivina per inhibició del seu promotor. La survivina es troba sobreexpressada en la majoria dels tumors. La survivina es troba altament expressada en gliomes a més està associada amb una menor supervivència i amb un augment de la recurrència tumoral. En aquest apartat de la tesi es va estudiar l’efecte de YM155 en línies cel•lulars i un cultiu primari de glioblastoma humà. Els resultats obtinguts mostren que el tractament amb YM155 provoca una disminució de la viabilitat cel•lular, així com inducció d’apoptosi, que s’acompanya d’una disminució dels nivells proteics de survivina en totes les línies cel•lulars de glioma avaluades. La incubació de les línies cel•lulars i del cultius primari mostra canvis en el patró de cicle cel•lular, provocant aturada tant en fase G0/G1 o en fase S depenent de la línia cel•lular avaluada. El pretractament amb YM155 abans de la radioteràpia indueix un augment en el nombre de focus de γ-H2AX. Els resultats de aquest apartat de la tesis suggereixen que la inhibició de la Survivina podria ser una nova eina terapèutica que permetria augmentar la sensibilitat a la radioteràpia en pacients amb glioblastoma multiforme.

Glioblastoma multiforme is the most common and aggressive primary brain tumor in adults, despite efforts to improve their treatment, patients survival remains poor. The purpose of this thesis is the study of molecular mechanism involved in the induction of apoptosis, cells cycle arrest as a consequence of the treatment with MDM2 and Survivin inhibitors in human glioblatoma multiforme. This effect has been studied ex vivo in glioma cell lines and primary cultured glioblastoma.

Nutlins small-molecule antagonist of MDM2, have been developed to inhibit p53-MDM2 interaction and activate p53 signaling in cancer cells. Nutlin-3a can induce cell cycle arrest (p21), apoptosi (PUMA and Noxa) in those cells with a functional p53 protein. In addiction Nutlin can induce cellular senescence (SA-βGal). In primary cultures and cells lines with a mutated p53 protein, Nutlin-3a fails to induce apoptosis and cell cycle arrest. Moreover Nutlin-3a pre-treatment in U87 cells sensitizes to radiotherapy.

YM155 is a small molecule inhibitor of antiapoptotic protein survivin. Survivin is overexpressed in glioma and is associated with decreased survival and increases tumor recurrence. YM155 treatment induces a decrease in cell viability, as well as an apoptosis induction. This is accompanied by a decreased in survivin protein levels in all glioma cell lines tested. Glioma cell line and primary culture incubation show changes in the cell cycle pattern, causing arrest either in G0/G1 or S depending of the cell line tested.